增强子重编程促进胰腺癌转移

文章题目：Enhancer Reprogramming Promotes Pancreatic Cancer Metastasis

研究人员：来自Cold Spring Harbor Laboratory的研究团队。

发表时间：2017. 07

期刊名称：Cell

影响因子：30.41

研究背景

胰腺导管腺癌（PDA）转移性很强，是人类最致命的恶性肿瘤之一。大多数PDA患者在诊断时已经有转移，手术或化疗干预的益处微乎其微。只有8%的病人，生存时间能超过5年。然而，目前PDA的转移机制尚不明确。

研究方法

实验材料：

KPC小鼠

从患者获取的胰腺癌组织样本

研究成果

原发灶和转移灶成对的小鼠，作为PDA转移机制研究的实验模型

图1

研究人员使用KPC小鼠（图1A），设置原发灶和转移灶，来研究PDA的转移机制。首先，研究人员采用实验手段来验证，PDA从原发灶和转移灶器官转移到KPC小鼠体内时，能否保留原有的特性。

1）胰腺原位注射发现，转移灶来源的4周内形成转移灶，而原发灶来源的需要3-4个月（图1B）。

2）尾静脉注射的结果：转移灶的可在9周左右在肺实质形成肿瘤，而原发灶的则看不到相应的肿块形成（图1C、图1D）。

3）肝门静脉或脾静脉注射结果：转移灶的能在肝内形成肿块，原发灶的则不能（图1E、图1F）。

4）皮下注射结果：转移灶形成的肿瘤体积明显更大（图1G）。

5）腹膜注射和皮下注射结果相同（图1H）。

由此可以看出：胰腺转移灶的肿瘤比原发灶更具侵袭性，我们可通过比较这些培养系，来进一步探究PDA转移机制。

PDA表观分析提示增强子的激活和肿瘤转变有关

图2

RNA-seq分析发现， Lin28b、Pdgfrb、和 Runx3de等已知的PDA转移调节因子在PDA细胞中有上调表达。为了研究增强子如何促进PDA的转移，研究使用在2个正常组织、2个上皮内瘤变、6对原发灶和转移灶中，研究全基因组水平的H3K27ac 变化。

1）最终研究人员得到857个GAIN区和1709个LOSS区（图2A）。同时H3K27ac的变化在6个转移灶样本中均有出现，与转移灶的解剖位置无关（图2B、图2C、图2D）。

2）90%的GAIN区和 LOSS 区在启动子之外，又和附近基因的表达模式一致，表明他们很可能存在于增强子区域（图2E）。

3）为了证实GAIN区存在增强子，研究人员使用ChIP-seq检测H3K4me1水平，以及 ATAC-seq技术测染色质可接近性。和预期一样，GAIN区存在h3k27ac、H3K4me1和染色质的可接近性。虽然H3K27ac 和 H3K4me1 在转移灶中增多，但是4种类型的样本中染色质可接近性类似，这表明GAIN区在正常导管上皮细胞中处于“沉着”状态。

FOXA1表达增强与PDA的转移以及GAIN增强子的激活相关

图3

研究人员通过TRAP算法证实了特定的转录因子在GAIN区富集，主要有AP1、SOX、Forkhead家族等（图3A）。由于RNA-seq中发现Forkhead家族的FOXA1在转移灶中是上调的，所以研究人员将研究重心放在了FOXA1（图3B）。Chip-seq分析也为FOXA1在转移灶中的GAIN区显著富集提供了佐证（图3C、图3D）。RNA-FISH也有相应发现（图3E）。

以上验证是在小鼠内进行的，研究人员也同步在人的PDA转移中做了验证。分析人PDA样本芯片数据发现，FOXA1在原发灶中上调，在转移灶中进一步升高（图3F），也通过qRT-PCR和免疫组库进行了证实。

FOXA蛋白作为先锋因子，在PDA转移过程中，原始内胚层组织分化为前肠细胞中必不可少（图3G）。GSEA分析发现GAIN区的基因在原始内胚层组织分化为前肠细胞中被激活（图3H、图3I），由此可见，FOXA1在胚胎前肠内胚层分化中起了重要的作用。

FOXA1高表达激活GAIN区增强子并与老鼠和人PDA转移相关性验证

图4

研究人员通过上调PDA中的FOXA1表达，来观察PDA的改变。

1）在KPC-2D细胞中导入FOXA1 cDNA不均一地提高了FOXA1的表达，以及GAIN区H3K27ac的量（如4A、图4B）。

2）RNA-seq分析表明，FOXA1的表达提高了GAIN增强子的表达和前肠内胚层特征基因增多（图4C）。

3）当细胞系作为肿瘤球体在超低粘附板上培养时，发现FOXA1的上调可以增强非锚定依赖性的细胞生长（图4D）。

4）当把KPC-2D细胞系放置在Matrigel-coated Boyden chamber时，FOXA1高表达使得细胞系具有了侵袭性（图4E）。

5）经尾静脉注射给小鼠时，FOXA1也提高了KPC-2D细胞的成瘤能力（图4F）。

6）在人PDA细胞系中也得到了相同的结论（图4G-4J）。

这些结果表明FOXA1过表达激活了GAIN区增强子，提高了PDA的转移能力。

FOXA1介导的增强子重编程在PDA转移中的充要性验证

图5

首先，研究人员验证了FOXA1上调对GAIN增强子活性提高是否是充分的。在原发灶中转入FOXA1，发现原发灶H3K27ac的水平只有转移灶的25%（图5A、图5B）。因此推断，可能有其它转录因子起了协同作用。研究人员又通过TRAP算法找到了GATA5, BATF2, PRRX2, 和PAX9在转移灶中高表达。由于GATA5在前肠内胚层中和FOXA1一样高表达，所以研究人员探究了GATA5的作用。单纯导入GATA5，H3K27ac水平仅为原来的1.1倍；GATA5+FOXA1一起导入，H3K27ac水平提高了42%（图5B、图5C）。原发灶中GATA5和FOXA1高表达也导致了GAIN区基因的高表达和前肠上皮细胞特征基因显著（图5D），小鼠的移植部位更容易出现肿瘤（图5E、图5F），转移灶增多（图5G），肿瘤体积变大（图5H）。这些研究结果表明，GATA5和FOXA1一起激活了GAIN增强子，促进了PDA体内转移。

图6

首先，研究人员探究了FOXA1上调对PDA的转移是否是必要的。研究人员采用了采用shRNA或CRISPR-Cas9技术减少了FOXA1的表达，发现GAIN区的H3K27ac水平降低（图6A-6C），RNA-seq分析发现FOXA1不足导致导致GAIN基因下调，前肠内胚层特征基因减少（图6D）。6周后，肿瘤体积明显减小（图6E），转移的可能性也将为之前的十分之一（图6F）。总之，这些发现表明，FOXA1介导的增强子重编程促进了PDA的体内转移。

总结

本研究使用使用类器官培养系统来研究在PDA小鼠模型的疾病进展的不连续阶段，转录本和增强子如何发生改变。 这种方法揭示了转移性转变过程中伴随着增强子活性的大量和反复改变。 FOXA1作为该系统中增强子激活的驱动因子，使PDA细胞获得更强的转移能力。 在这个系统中，FOXA1-dependent 增强子重编程激活了胚胎前肠内胚层的转录程序。 总的来说，我们的研究表明增强子重编程，FOXA1上调和PDA转移逆向发展转变。

参考文献：

[1]Jae-Seok Roe, Chang-Il Hwang, Tim D.D.Somerville, et, al.Enhancer Reprogramming Promotes Pancreatic Cancer Metastasis[J].Cell,2017, 170(5): 875-888.