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社区首页 >专栏 >🤩 scRNA-seq | 吐血整理的单细胞入门教程（数据格式和处理）（四）

🤩 scRNA-seq | 吐血整理的单细胞入门教程（数据格式和处理）（四）

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生信漫卷
发布于 2022-10-31 17:19:27
发布于 2022-10-31 17:19:27
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文章被收录于专栏：R语言及实用科研软件R语言及实用科研软件

1写在前面

我们还是在正式进行代码操作前想几个小问题：👇

  • 如何将单细胞数据导入R中？
  • 不同类型的数据/信息（如细胞信息、基因信息等）是如何存储和操作的？
  • 如何获得细胞和基因的基本信息并对数据进行相应的过滤？

2用到的包

目前常用的scRNA-seq分析包，包括Seurat、Scanpy(python)、Scater、Monocle2、Monocle3等。🤒

代码语言：javascript
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rm(list = ls())
library(tidyverse)
library(SingleCellExperiment)
library(DropletUtils)

3数据格式

scRNA-seq的标准格式为SingleCellExperiment。😘 Note! Seurat包有其自己的格式，即Seurat格式，可能因为Seurat太火了吧，越来越多的包都开始兼容Seurat格式的文件了。😂

我们拿到的数据通常是一个feature-by-sample的表达矩阵。 在scRNA-seq分析中，我们一般需要从counts矩阵开始分析，代表每个cell的feature的reads/UMI。feature可以是gene、isoforms或exons。🤒

singlecellexperiment

4SingleCellExperiment对象

4.1 读入数据

代码语言：javascript
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counts <- read.table("./molecules.txt", sep = "\t")
annotation <- read.table("./annotation.txt", sep = "\t", header = TRUE)

counts

annotation

4.2 创建SingleCellExperiment对象

代码语言：javascript
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# 注意assays必须是matrix
tung <- SingleCellExperiment(
  assays = list(counts = as.matrix(counts)),
  colData = annotation
)

tung

Note! 这个SingleCellExperiment包含：

  • 19027个基因(行)和864个细胞(列);
  • 一个名为counts的assays;
  • 预览部分基因名(rownames)和细胞名(colnames);
  • 基因的metadata为空 (rowData);
  • 细胞的metabdata(colData names)

510X 文件的读取

像上面那样创建SingleCellExperiment对象,几乎适用于任何情况，我们只需要一个counts矩阵即可。 🤗 但有时候我们获取的文件是cellranger（用于10X Chromium数据）的输出文件，这个时候我们可以用DropletUtils包中的read10xCounts函数。😀

代码语言：javascript
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sce <- read10xCounts("./pbmc_1k_raw")

sce <- read10xCounts("./pbmc_1k_filtered")
sce

6查看数据

6.1 查看counts矩阵

这里需要说一下的是，如果你的矩阵就叫counts,那么counts(tung) = assay(tung, "counts")。

代码语言：javascript
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counts(tung)
assay(tung, "counts")[1:4,1:4]

6.2 查看cell信息

代码语言：javascript
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colData(tung)

6.3 查看batch信息

代码语言：javascript
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table(tung$batch)

🧐 补充！

Function

Description

rowData(sce)

gene信息

colData(sce)

cell信息

assay(sce, "counts")

查看counts矩阵

reducedDim(sce, "PCA")

查看PCA降维table

sce$colname

查看colData的colname, 等价于colData(sce)$colname

sce[<rows>, <columns>]

查看特定行、列

7修改SingleCellExperiment对象

举个栗子 🌰 我们把counts矩阵进行log2(x+1)转换，命名为logcounts。

代码语言：javascript
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assay(tung, "logcounts") <- log2(counts(tung) + 1)
# 查看一下
logcounts(tung)[1:4, 1:4]

🧐 补充！

Code

Description

assay(sce, "name") <- matrix

添加新矩阵

rowData(sce) <- data_frame

替换rowData

colData(sce) <- data_frame

替换colData

colData(sce)$column_name <- values

在colData中添加/替换一个新的列

rowData(sce)$column_name <- values

在rowData中添加/替换一个新的行

reducedDim(sce, "name") <- matrix

添加降维矩阵

8基本数据处理

8.1 举个栗子🌰

计算我们的数据集中每个细胞（列）的平均counts。 然后我们将它加到column metadata中作为新的一列。😘

代码语言：javascript
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colData(tung)$mean_counts <- colMeans(counts(tung))

这个时候我们可以查看一下，多了一列mean_counts。🤔

代码语言：javascript
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colData(tung)[1:4,]

8.2 补充一下

这里我们再补充一下基本函数。有兴趣的小伙伴都试试吧。🫶

  • row (feature) summaries
代码语言：javascript
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rowSums(counts(tung))  # sum
rowMeans(counts(tung)) # mean
rowSds(counts(tung))   # standard deviation
rowVars(counts(tung))  # variance
rowIQRs(counts(tung))  # inter-quartile range
rowMads(counts(tung))  # mean absolute deviation
  • column (sample) summaries
代码语言：javascript
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colSums(counts(tung))  # sum
colMeans(counts(tung)) # mean
colSds(counts(tung))   # standard deviation
colVars(counts(tung))  # variance
colIQRs(counts(tung))  # inter-quartile range
colMads(counts(tung))  # mean absolute deviation

9CPM的计算与查看

9.1 CPM的计算

这里我们直接使用sweep函数来搞定counts转CPM，在这之前我们先计算一下total counts并新增一列。

代码语言：javascript
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colData(tung)$total_counts <- colSums(counts(tung))
assay(tung, "cpm") <- sweep(counts(tung),2,tung$total_counts/1e6,'/')

# check一下
colSums(cpm(tung))[1:10]

9.2 CPM矩阵的查看

代码语言：javascript
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cpm(tung)[1:4, 1:4]
assay(tung, "cpm")[1:4, 1:4]

10常用过滤方法

拿到矩阵后，我们一般需要过滤一些低表达或异常表达值。 举个栗子 🌰，假设细胞至少25000counts，基因在至少一半的细胞中拥有超过5个counts。

10.1 过滤细胞

代码语言：javascript
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cell_filter <- colSums(counts(tung)) >= 25000

# check一下
table(cell_filter)

10.2 过滤基因

代码语言：javascript
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gene_filter <- rowSums(counts(tung) > 5) > ncol(tung)/2

# check一下
table(gene_filter)

10.3 最终过滤

代码语言：javascript
复制
tung_filtered <- tung[gene_filter, cell_filter]

tung_filtered

10.4 补充一下

代码语言：javascript
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colSums(counts(sce)) > x # 对细胞进行过滤, Total counts per cell greater than x。

colSums(counts(sce) > x) > y # 对细胞进行过滤，Cells with at least y genes having counts greater than x.

rowSums(counts(sce)) > x # 对基因进行滤过，Total counts per gene greater than x.

rowSums(counts(sce) > x) > y # 对基因进行过滤，Genes with at least y cells having counts greater than x.

最后祝大家早日不卷!~

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原始发表：2022-10-05，如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除
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  • 1写在前面
  • 2用到的包
  • 3数据格式
  • 4SingleCellExperiment对象
    • 4.1 读入数据
    • 4.2 创建SingleCellExperiment对象
  • 510X 文件的读取
  • 6查看数据
    • 6.1 查看counts矩阵
    • 6.2 查看cell信息
    • 6.3 查看batch信息
  • 7修改SingleCellExperiment对象
  • 8基本数据处理
    • 8.1 举个栗子🌰
    • 8.2 补充一下
  • 9CPM的计算与查看
    • 9.1 CPM的计算
    • 9.2 CPM矩阵的查看
  • 10常用过滤方法
    • 10.1 过滤细胞
    • 10.2 过滤基因
    • 10.3 最终过滤
    • 10.4 补充一下
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