PICRUSt不灵啦？别慌，它一直都不咋灵~

PICRUSt作为利用16S进行功能预测的方法，使用非常广泛。但是其利用Greengene作为参考数据库，由于Greengene更新缓慢，在如今测序技术发展一日千里、成本不断下降、新序列的出现日新月异的条件下，其准确性一直都受到质疑(没有文献参考，起码受到我的质疑0.0)。

另外这种基于系统发育关系判定功能的方法本身也是一种近似，其本身就存在很多的偏差。

前几天看到一篇文章介绍了bipRxiv上一项研究，说PICRUSt存在很大的问题。

文章中指出PICRUSt主要的问题在于其预测的准确性和宏基因组相差太多，人类肠道样本效果还稍微好一点，环境样本，尤其是土壤样本效果很差。如下图所示(记为A)。

巧的是，在PICRUSt方法发表的文章中也有一张图，用的恰好也是土壤样本。其结论是说在低测序深度条件下PICRUSt更准确，高测序深度宏基因组更准确。如下图所示(记为B)。

这就让我对bipRxiv的结论很有兴趣。我没有看bipRxiv的原文，只是找了他们用到的样本信息，如下表所示。

事先声明，以下结论全为自己推论，没有证实，只是一时发散思维的想法，切莫当”真”。。。

样本LWM对应的表中的第7行，样本AAN对应表中的第8行。仔细看他们的16S序列数和宏基因序列数。LWM的16S序列远高于AAN，而其宏基因组序列数远低于AAN。两样本的序列数都高于20,000，测序深度较高，在图B中表明宏基因组的结果都要好于16S+PICRUSt，比较吻合。

那么再回到bipRxiv中的那张图A，LWM由于16S很多，PICRUSt准确性也较高，和宏基因组重合比例较高。AAN的16S序列很少，而宏基因组数据特别多，因此PICRUSt预测效果很差，和宏基因组重合比例很低，这也完全解释的通。

所以bipRxiv说土壤样本不准，可能是因为测序深度比较深，也可能是因为宏基因组数据太多而16S数据太少，使得两者差异较大。

为了进一步验证我的猜想，继续看其他类型的样本。如第5行的mouse和第6行的chicken,两者由于16S序列很少，小于10,000，根据图B表明PICRUSt应该比宏基因组准确性更高。随着宏基因组序列数的大幅增加(mouse到chicken)，PICRUSt和宏基因组的重叠果然也大幅增加(图A)。

综合上述瞎猜，可以得出参考基因组；测序深度；以及16S和宏基因组相对数据量会影响PICRUSt准确性。

测序深度在以后只可能更深，因此PICRUSt准确性不如宏基因组已成事实。bipRxiv的研究在样本的选择上存在很多问题，只凭一篇文章并不能把PICRUSt一巴掌拍死。

近期出了PICRUSt2，可参考：

PICRUSt2 Tutorial (v2.1.4 beta)

https://github.com/PICRUSt/PICRUSt2/wiki/PICRUSt2-Tutorial-(v2.1.4-beta)#place-reads-into-reference-tree

PICRUSt2 里的Key Limitations也说了，预测主要受限于现有参考基因组的基因。

对于16S，其基因序列通常不能分辨一个物种内的菌株变异。原核物种菌株的基因含量差异很大，在亲缘关系较远的类群之间经常发生水平基因转移，因此对预测结果应小心。

另外，参考基因组的选择也会影响结果。如与牛瘤胃相比，PICRUSt2在人类肠道的16S序列上表现得更好，即使实际的16S序列本身非常相似。其原因是许多重要的瘤胃特异性酶在默认的参考基因组中缺失。这个问题的一个潜在解决方案是创建一个特定的基因组参考数据库，该数据库只针对感兴趣的环境进行预测。

Reference

Shan Sun, RoshondaB. Jones, Anthony A. Inference based PICRUSt accuracy varies across sampletypes and functional categories. FodorbioRxiv 655746; doi: https://doi.org/10.1101/655746

Langille M GI, Zaneveld J, Caporaso J G, et al. Predictive functional profiling ofmicrobial communities using 16S rRNA marker gene sequences[J]. Naturebiotechnology, 2013, 31(9): 814.

完