三代测序错误率比较高,一般组装后需要进行纠错来提高准确度。本次介绍使用Pilon通过引入二代测序数据来对三代基因组进行纠错,此外Pilon还支持对二代测序数据拼接结果进行纠错。
https://github.com/broadinstitute/pilon/wiki
# conda安装pilon
conda install -y pilon
# 编译安装
wget https://github.com/broadinstitute/pilon/releases/download/v1.24/pilon-1.24.jar
chomd 755 pilon-1.24.jar
Tips:如果wget无法下载建议用浏览器下载后自行传入服务器
# 下载二代测序数据用于纠错
wget \
-O illumina.sra \
https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR8482586/SRR8482586
Tips: 本期需要纠错的基因组选择上期推文中Flye组装的nanopore数据进行演示,即下文中出现的assembly.fasta
fastq-dump --split-files --gzip illumina.sra
Tips: fastq-dump会将sra格式转化成fastq格式,同时--gzip参数会对fastq进行压缩,示例illumina.sra最终会被转化为illumina_1.fastq.gz 和 illumina_2.fastq.gz
# 输入参数
--genome : 输入基因组序列文件,即需要纠错的文件;
--frags : 输入Illumina小片段文库(FR方向)测序数据比对到参考基因上的BAM文件路径。该BAM文件是需要按coordinate排序,且具有.bai索引;
--jumps : 输入Illumina大片段文库(RF方向)测序数据比对到参考基因上的BAM文件路径。该BAM文件是需要按coordinate排序,且具有.bai索引;
--unpaired : 输入Illumina单端测序数据比对到参考基因上的BAM文件路径。该BAM文件是需要按coordinate排序,且具有.bai索引;
--bam : 输入未知类型的Illumina测序数据比对到参考基因上的BAM文件路径。该BAM文件是需要coordinate排序,且具有.bai索引。程序能自动识别测序文库类型。
# 输出参数
--output : 设置输出文件前缀;
--outdir : 设置输出文件夹路径;
--changes : 加入该参数会生成一个包含基因组序列改变信息的文本文件;
--vcf : 加入该参数后,会生成一个vcf格式文件;
# 运行参数
--fix : 该参数用于设定pilon对基因组进行指定类型的修正,该参数的值是用逗号分隔的多个单词。pilon可以对基因组进行多种类型的修正。
--threads : 设置线程数
Tips: --fix参数选择:snps,修正单碱基错误;indels,修正小的插入缺失错误;gaps,补洞处理;local,检测序列中的组装错误,并进行基因组局部再组装,从而对错误进行修正;all,修正以上4种错误;none,不进行错误修正,同时也不生成新的FASTA文件;amb,修正ambiguous碱基;breaks,在修正local错误时,会进行基因组局部再组装,此过程中允许插入gap;novel,允许利用未能比对到基因组序列上的小片段文库数据组装出新的基因组序列。
Tips: 示例使用的是conda安装的Pilon
# 对拼接结果建立索引(如何获得assembly.fasta详见Flye三代基因组推文)
bwa index assembly.fasta
# illumina与assembly.fasta进行比对,生成assembly_illumina.sam结果文件
bwa mem -t 12 assembly.fasta illumina_1.fastq.gz illumina_2.fastq.gz > assembly_illumina.sam
# 将assembly_illumina.sam进行排序,生成assembly_illumina.sorted.bam 文件
samtools sort -@ 12 -O bam -o assembly_illumina.sorted.bam assembly_illumina.sam
# 对排序后的文件建立索引,生成assembly_illumina.sorted.bam.bai文件
samtools index assembly_illumina.sorted.bam
# 运行Pilon
pilon --genome assembly.fasta \
--fix all \
--changes \
--frags assembly_illumina.sorted.bam \
--output pilon \
--outdir pilon_result \
--vcf
Tips:如果使用自行编译的Pilon,需要将其加入环境变量后使用或者使用Pilon的绝对路径,绝对路径根据自己安装的位置而定,示例中的安装地址是/opt/biosoft/GENOME/pilon/pilon-1.23.jar,用法如下:
java -jar \
/opt/biosoft/GENOME/pilon/pilon-1.23.jar \
--genome assembly.fasta \
--fix all \
--changes \
--frags assembly_illumina.sorted.bam \
--output pilon \
--outdir pilon_result \
--vcf
Tips: 软件运行过程中可能会遇到下面的报错信息,这是由于软件设定的内存不足造成的
Exception in thread "main" java.lang.OutOfMemoryError: Java heap space
at org.broadinstitute.pilon.BaseSum.<init>(BaseSum.scala:24)
at org.broadinstitute.pilon.PileUp.<init>(PileUp.scala:27)
at org.broadinstitute.pilon.PileUpRegion.$anonfun$new$1(PileUpRegion.scala:30)
at org.broadinstitute.pilon.PileUpRegion$$Lambda$52/0x0000000100178840.apply$mcVI$sp(Unknown Source)
at scala.collection.immutable.Range.foreach$mVc$sp(Range.scala:190)
at org.broadinstitute.pilon.PileUpRegion.<init>(PileUpRegion.scala:30)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeRegion.initializePileUps(GenomeRegion.scala:150)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.$anonfun$processRegions$4(GenomeFile.scala:104)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.$anonfun$processRegions$4$adapted(GenomeFile.scala:102)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile$$Lambda$51/0x0000000100169840.apply(Unknown Source)
at scala.collection.immutable.List.foreach(List.scala:333)
at org.broadinstitute.pilon.GenomeFile.processRegions(GenomeFile.scala:102)
at org.broadinstitute.pilon.Pilon$.main(Pilon.scala:111)
at org.broadinstitute.pilon.Pilon.main(Pilon.scala)
解决办法如下:
# 查询pilon路径
which pilon
# 修改pilon配置
vim /home/miniconda3/envs/NGS/bin/pilon
修改下图红色框,将 -Xmsg和-Xmx对应的数值调大,再次运行即可成功。
pilon.changes # 该文件列出了纠错的位点
pilon.fasta # 最终纠错后文件
# 有多少行代表有多少错误被纠正
wc -l pilon.changes
# 统计纠错前后文件信息
seqkit stats pilon.fasta assembly.fasta
Tips: 建议多次迭代运行Pilon进行纠错,尽可能修正更多的错误位点。