scRNA和Bluk RNA联合分析构建肝细胞癌干细胞特征并探索其对患者预后和治疗的影响

hello呀 各位bro and sis，看到这个开场白，你们就知道今天是我来share文献了，我还是我，又练肌肉又学科研的废柴儿科医生。从一个搞笑博主变成正经博主只需要一周一个班，以后例行每周一就是我的班了。

上次我们分享了一个纪念凯瑟琳癌症中心的文章，看起来确实是太复杂了，不愧是国际领先机构（真有钱）。本来是继续share安德森癌症中心的，不过前段时间听说这个单位某些导师pua，我还是算了吧，别share这个了。今天我们share一个2024年的吧：

整合单细胞RNA-seq和bulk RNA-seq构建肝细胞癌干细胞标签，以探索其对患者预后和治疗的影响

1基本信息：

• 发表期刊：PLOS ONE
• DOI：10.1371/journal.pone.0298004
• 发表时间：April 18, 2024
• 样本类型：肝细胞癌（LIHC）患者的肿瘤组织样本

2背景知识

看这个文献之前，首先要知道下面的几个背景知识：

• LIHC是原发性肝癌的一种普遍形式。
• 肿瘤干细胞在促进肿瘤复发、转移和治疗抗性方面有重要作用。
• 肿瘤细胞在基因组、表观基因组、蛋白质组和转录组水平上的特征与癌细胞的分化表型丧失和干细胞特性获得密切相关。
• CytoTRACE是基于单细胞RNA测序数据的新算法，用于预测恶性细胞群体的分化状态。
• mRNAsi是一种基于mRNA表达的干细胞指数，与CSCs的生物学过程密切相关。

知道了这些那我们就好办了，用人话说：这篇文章详细阐述了肝细胞癌（LIHC）的严峻现状和癌症干细胞（CSCs）在肿瘤中的关键作用，特别是在肿瘤的复发、转移和治疗抗性中的作用。

肝细胞癌的流行病学和预后

肝细胞癌是全球范围内最常见的肝癌类型之一，是导致癌症相关死亡的第三大原因。尽管有多种治疗选项，如手术、化疗、免疫疗法和肝动脉栓塞，但由于LIHC的高度异质性，其治疗效果有限，很多患者的预后仍然不佳。这种异质性导致肿瘤对现有治疗方法具有不同的响应性，使得治疗成效受限。

癌症干细胞（CSCs）的角色

癌症干细胞是指在肿瘤中占少数的干细胞样癌细胞，它们具有自我更新和分化为多种细胞类型的能力。CSCs被认为是导致肿瘤复发和转移的主要原因，并能增强肿瘤对治疗的抵抗力。研究显示，CSCs通过多种机制，包括表观遗传调控和细胞信号转导途径的改变，促进肿瘤生长和逃避免疫监视。

研究缺口

尽管CSCs在肿瘤中的重要性已经被认识到，但目前对它们的理解仍有限，特别是在肝细胞癌中，缺乏能够精确描述CSCs特性和功能的基因标记。此外，没有有效的CSCs相关的基因签名来预测肝细胞癌患者的预后或指导其治疗决策。这些问题限制了针对肝细胞癌的个性化医疗策略的发展。

研究的必要性

由于肝细胞癌的治疗挑战和CSCs在疾病进程中的关键作用，开发新的诊断和治疗策略变得至关重要。特别是，通过理解和利用CSCs的基因表达特征，可能会开辟新的治疗肝细胞癌的途径，提高治疗的针对性和效果，从而改善患者的预后。

3结果

共鉴定了与干性评分（CytoTRACE评分和mRNAsi）相关的4个基因（包括STIP1、H2AFZ、BRIX1和TUBB），并构建了可预测LIHC患者预后的风险模型。据观察，高干细胞主要发生在LIHC的晚期，LIHC患者的总体生存率差也与高mRNAsi评分相关。此外，通路分析证实了两个风险组的生物学独特性。个性化治疗预测表明，低风险患者从免疫治疗中获益更多，而高风险人群可能有利于化疗药物。

4结论

建立了一种新的CSC相关基因的预后风险标记，为LIHC的诊断、预后和治疗提供了新的思路。

好了知道了这些知识，那我们开始分析一下具体的图吧：

Figure1

• A：使用数据集（GSE149614）从LIHC患者中选择21个样本，包括10个肿瘤样本、8个正常样本、2个PVTT样本和1个淋巴样本。获得了总共7种细胞类型，包括免疫细胞（例如，B细胞、骨髓细胞和T/NK细胞）和非免疫细胞（例如，内皮细胞、上皮细胞、肝细胞和成纤维细胞）。（1A）（tips：这里提到一个，很多朋友说没有数据，这不也是各种筛选后merge的吧）UMAP展示了不同细胞类型的分布：包括B细胞、内皮细胞、上皮细胞、肝细胞等，每种细胞类型用不同颜色表示。
• B. 鉴定了7种细胞类型的标记基因，展示了不同细胞类型的标记基因表达水平和表达百分比。
• C. 免疫细胞和非免疫细胞在不同样本中的比例：正常细胞相比，作者发现T/NK细胞显著耗尽，髓样细胞在肿瘤细胞中显著富集图展示了免疫细胞和非免疫细胞在淋巴结、正常组织、门静脉肿瘤栓塞（PVTT）、肿瘤样本中的分布比例。
• D. 细胞类型在不同样本中的分布，显示各细胞类型在不同样本（如淋巴结、正常、PVTT、肿瘤）中的比例。可以看出来：LIHC中的肿瘤细胞比正常细胞具有显著更高的上皮细胞比例
• E. 肿瘤不同阶段的细胞分布，通过UMAP显示了来自不同癌症阶段的细胞分布。
• F. CytoTRACE分析，使用CytoTRACE算法评估的细胞分化状态。在肝癌组织中，上皮细胞被认为在肿瘤组织的增殖中起关键作用。为了消除LIHC的scRNA-seq数据中非病变和转移性组织样本中的细胞的影响，作者仅使用CytoTRACE算法计算了LIHC中上皮细胞的CytoTRACE评分。通过比较不同病理阶段之间原发性肿瘤上皮细胞CytoTRACE评分的差异，观察到高度干细胞化的肿瘤细胞主要富集在晚期（III期和IV期）（图1E和1F）
• G. 细胞类型与肿瘤阶段的相关性，上皮细胞在IV期中的比例高于其他六种细胞类型。
• H. 展示了CytoTRACE分数与选定基因表达的相关性。鉴定了CytoTRACE评分中具有最高相关性的前10个基因，包括RPLP2、NACA、FAU、RPS9、RPL35、RPL18、RPL7A、ATP5G2、RPL5、RPS5（图1H）。

Figure2：

为了探讨mRNAsi在LIHC中的作用，作者研究了mRNAsi对LIHC患者生存率和LIHC相关临床特征（包括分期和分级）的影响。

• A&B：基于TCGA-LIHC数据集和HCCDB18数据集中的KM曲线，作者发现升高的mRNAsi表达水平与LIHC患者的不良总生存期（OS）显著相关（图2A和2B）。
• C：在TCGA-LIHC中，mRNAsi评分在IV期较低（图2C）。这很可能是因为TCGA数据库提供的样本量太小，IV期只有4份样本。
• D：显示了不同级别LIHC之间mRNAsi的显著差异，并且随着级别的增加，mRNAsi评分也增加。这意味着LIHC中mRNAsi的表达与肿瘤分级正相关。
• E：mRNAsi评分随分期增加（图2 E）。

Figure3:

• A&S2&S1:使用WGCNA将TCGA-LIHC数据集中的13906个基因分成10个基因共表达模块。这10个基因共表达模块的表达信息如S1图所示（https://doi.org/10.1371/journal.pone.0298004.s001，也可以点击阅读原文跳转查看），可以发现棕色模块与mRNAsi显著正相关，有TOP2A、MKI67、E2F1、BUB1B等349个与细胞周期相关的基因。
• B：KEGG富集分析结果显示前10个聚类及其代表性富集项。针对参与细胞周期、DNA复制、同源重组和细胞衰老的途径，鉴定了这些mRNAsi相关基因中的富集术语。
• C：染色体区域、染色体分离和受损的DNA结合受到LIHC中mRNAsi相关基因的显著调节，如GO富集分析的结果所示。

Figure4:

• A：LIHC中肿瘤干细胞相关预后模型的构建进一步筛选与LIHC预后相关的关键基因。作者选择了scRNA-seq数据中与CytoTRACE相关性大于0.4的856个基因，以及与mRNAi相关的WGCNA基因。
• B：总共鉴定了16个与LIHC预后相关的基因用于进一步分析，并且它们都显示出预后意义。
• C：通过LASSO回归分析筛选出4个具有预测价值的基因（STIP1、H2AFZ、BRIX1和TUBB），并将其用于预测模型的构建。采用多因素考克斯回归分析进一步验证，相关系数计算公式为：Risk score =（0.426 × STIP1表达）+（0.203 × H2AFZ表达）+（0.421×BRIX1表达）+（-0.228 × TUBB表达）。
• E&H：通过生存分析评估与干细胞指数相关的预后模型的可靠性。与低风险组相比，高风险患者的OS、DSS、DFEI和PFI降低更明显。
• I：生存差异结果显示，与LIHC高风险患者相比，低风险患者的存活率更高。
• K&L：在HCCDB18群组中获得了相同的结果。
• D&J：作者分别对TCGA和HCCDB18队列进行了ROC曲线分析。结果显示，TCGA队列在1年、3年和5年时的ROC曲线下面积，分别为0.76、0.70和0.69，HCCDB 18队列分别为0.67、0.73和0.77。曲线下面积（AUC）越接近1表示模型的预测能力越强。

Figure5:

• A&B：发现AJCC分期和风险评分是LIHC患者的显著预后风险因素。
• C：结合风险评分和AJCC分期建立列线图，量化LIHC患者的风险评分和生存概率。发现风险评分是所有变量中对生存率影响最大的变量。
• D&E：构建的诺模图具有良好的预测性能，DCA显示了风险模型的可靠性。
• F&G：进一步了解四个预后关键基因（包括STIP1、H2AFZ、BRIX1和TUBB）分别在TCGA数据集和单细胞谱中的表达。所有四种预后关键基因在LIHC高风险组和上皮细胞中均显示出高表达。

Figure6:

• A&B：评估了TCGA-LIHC和HCCDB 18队列中风险评分与mRNAsi之间的相关性。结果显示风险评分与mRNAsi正相关。
• C&D&E：在TCGA-LIHC和HCCDB18组群中跨分期和分级的风险评分分布的比较表明，风险评分随着分期和分级而增加。TCGA-LIHC队列中的样本数量较少导致IV期的性能偏倚。GSEA网站获得了文件“h.all.v2023.1.Hs.symbols.gmt”中的访问信息，并应用ssGSEA算法对其进行评分。在TCGA队列中，LIHC和30种癌症相关通路的不同风险组之间存在显著差异（p<0.01）。（这个是一个很重要的评分要点）
• F：LIHC低危组主要富集与代谢相关的途径，如胆汁酸代谢和脂肪酸代谢，而高危组在细胞周期相关途径中具有更高的活性。
• G：GSEA分析显示了类似的结果，并证明了LIHC高风险组在细胞周期相关途径上的显著富集。炎症相关通路WNT_BETA_CATENIN_SIGNALING、TNFA_SIGNALING_VIA_NF κ B、IL 2_STAT5_SIGNALING均在高危组中富集。这些发现表明，所建立的风险模型与癌症的干性密切相关，并且可以很好地区分具有不同临床信息以及干扰途径的LIHC患者。

Figure7：

为了探索LIHC高风险组和低风险组患者之间肿瘤微环境（TME）的差异，我们首先使用ssGSEA算法评估了28种免疫细胞在风险组中的渗透程度差异。

• A：作者发现高风险组中的患者也具有比低风险组中的患者显著更高的适应性免疫评分。
• B：LIHC高风险组中的例患者的免疫细胞浸润评分在大多数细胞中高于低风险患者，例如嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞、T滤泡辅助细胞、活化树突状细胞、MDSC和CD4 T细胞。
• C&D：在高风险组中也观察到相对高比例的免疫细胞，尤其是巨噬细胞。

Figure8:

• A：免疫应答和药物敏感性分析，LIHC低风险患者的TIDE评分显著低于高风险组患者。
• B：低风险患者的免疫应答百分比高于高风险组。表明低风险LIHC组的患者更有可能从免疫治疗中获益。TMB也被认为是肿瘤免疫治疗反应率的生物标志物，高TMB患者从免疫治疗中获益更多，OS更长。
• C：TMB在不同风险组的LIHC患者之间没有显著差异（p = 0.59）。
• D：作者发现在KM生存分析中，当结合风险评分时，低风险和低TMB患者显示最长的OS，而高风险和高TMB患者显示最短的OS。
• E：免疫调节剂相关基因在LIHC的不同风险组中的患者中的表达在高风险组中也显示出显著的高表达。
• F：LIHC高危组患者对舒尼替尼、依托泊苷、吉西他滨、阿霉素、毒胡萝卜素、乙胺嘧啶和长春瑞滨等29种药物敏感。低风险组中厄洛替尼、TGX221、CGP60474和Saracatinib的较低IC50值甚至更低，这意味着风险评分较低的患者可能从这些药物中获益更多。这些结果表明，CSC特征可以预测LIHC患者的治疗敏感性。

5临床意义：

这篇文章主要研究了肝细胞癌（LIHC）的风险评分系统，并探讨了其与患者的临床特征、免疫细胞浸润、基因表达模式、药物敏感性之间的关系。主要体现在下面的几个方面，当然这篇文章真的套路可以值得所有临床医生学习，因为简单实用：

• 风险评分系统的建立和验证 文章通过大量的临床数据和生物信息学分析建立了一个基于基因表达的风险评分系统。这一系统能够有效地将患者分为高风险和低风险两组，其中高风险组患者具有较低的生存率。这种分类方法对于预测患者的预后具有重要价值。（简单的两分组）
• 患者个体化治疗的指导 通过分析不同风险组患者的药物反应性，文章指出了某些药物对特定风险组患者可能更为有效。临床上可以根据患者的风险评分选择最合适的治疗策略提供了依据，有助于实现个体化治疗。（精准医疗，领导最喜欢的词）
• 免疫微环境的研究 文章通过分析风险评分与肿瘤微环境之间的关系，揭示了高风险和低风险患者在免疫细胞浸润和表达特定免疫相关基因方面的差异。这一发现对于理解肿瘤的免疫逃逸机制和开发新的免疫治疗策略具有潜在价值。（解释了患者问你：他吃那个好了，我吃这个没好，为啥呢）
• 预测治疗反应 通过将风险评分与治疗反应性相关联，文章为临床医生在治疗前评估患者对治疗可能的反应提供了工具，特别是在使用特定药物治疗时。
• 炎症标记物的角色探讨 尽管文章中提到炎症标记物在不同风险组中的差异不显著，但其对炎症在肿瘤发展中作用的进一步研究可能有助于理解肿瘤的生物行为。

今天的这个文章真的很有意思，单细胞+WGCNA+KEGG+一些小的通路筛选之类的，这个套路可以用于各种文章，只要你想做。

文章很好，我这个分析只是一个皮毛，原文很值得大家去细细研读，重点的是这个文章的书写的套路可以为我们数据挖掘文章提供一个很好的模版。好了，今天的文献解析就到这吧。如果喜欢这种风格，欢迎各位朋友们点点在看，点点赞。