SLEEP：发育过程中睡眠慢波振荡-纺锤波耦合先于纺锤波-波纹耦合

1. 摘要

目标：睡眠通过在慢波睡眠期间特定振荡事件的精确时间协调来支持系统记忆巩固，即新皮质慢波振荡（SOs）、丘脑纺锤波和海马波纹。尽管婴儿期也观察到了睡眠对记忆的有益影响，但相关区域，尤其是海马和额叶皮层，尚未成熟。我们在大鼠中研究了这些振荡事件及其在早期生命中的耦合发展。

方法：在雄性大鼠的睡眠期间记录了脑电图（EEG）和海马局部场电位，分别在出生后第26天（PD26）和第32天（PD32），大致相当于人类的早期（1-2岁）和晚期（9-10岁）儿童期，以及一组成年大鼠（14-18周，相当于人类的22-29岁）。

结果：从PD26到PD32，SOs和纺锤波的振幅普遍增加。同时，额叶皮层的EEG纺锤波在密度和频率上增加，而海马波纹的变化则不显著。SOs与纺锤波同时发生的比例也从PD26增加到PD32。尽管在PD26时顶叶皮层的纺锤波已经与去极化的SO上升相位锁定，但额叶皮层的SO-纺锤波相位锁定直到PD32才出现。海马波纹与纺锤波的共现率在儿童期高于成年大鼠，但只有在成年大鼠中观察到波纹与纺锤波谷的显著相位锁定。

结论：结果表明，额叶皮层网络（即额叶SO-纺锤波耦合）中特定的丘脑皮层处理的同步化发展较为缓慢。然而，丘脑皮层网络内的同步化通常先于丘脑皮层与海马处理的同步化，这反映在纺锤波-波纹相位耦合的延迟出现上。

关键词：发展；纺锤波；慢波振荡；波纹；海马；皮层

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图摘要. 睡眠期间的记忆巩固是由海马体和新皮层网络之间的交互介导的，已知，该网络依赖于海马体涟漪和丘脑皮层慢波振荡（SOs）和纺锤波的同步发生。当这种睡眠振荡事件之间的时间耦合会在生命早期出现时，那时海马体和额叶皮层还不成熟，这是未知的。在大鼠模型中，我们记录了与儿童早期和晚期相对应的新皮质脑电图和海马局部场电位。我们发现，虽然在儿童时期，SOs、纺锤波和波纹经常同时发生，但精确的相位耦合，特别是波纹与纺锤波振荡，发生在发育期间相当晚。这表明，生命早期睡眠依赖性记忆形成的机制可能与成年期不同。

2. 引言

睡眠是一个动态过程，在大脑发育和长期记忆形成中起着关键作用。睡眠期间的记忆巩固可能是通过一个主动的系统巩固过程实现的，其中在海马网络中锚定的情景记忆逐渐转化为主要存在于新皮质网络中的更抽象的语义记忆。越来越多的证据支持这样一种观点，即这种记忆向新皮质语义表征的转化主要是通过慢波睡眠（SWS）的三种主要节律的精确相位耦合来介导的，即<1.5 Hz的新皮质慢波振荡（SOs）、10-16 Hz的丘脑纺锤波和约180 Hz的海马波纹。SO包括一个全球网络超极化和神经元沉默的下降状态，随后是一个显著增加的兴奋性去极化上升状态，倾向于在其上升状态中嵌套一个相位锁定的纺锤波。反过来，丘脑纺锤波不仅传播到新皮质，还通过不同的可能途径（如核团、内嗅皮层）传播到海马网络，在那里它们倾向于嵌套在其振荡的可兴奋波谷中，伴随着海马细胞群中的记忆重放。这种SOs到纺锤波到波纹的跨频率三重耦合可能会门控新获得的海马记忆信息向新皮质的转移，从而将表征巩固到新皮质网络中。

虽然神经机制的记忆巩固和记忆转换在睡眠期间主要探索在成熟的大脑，越来越多的证据表明，睡眠支持记忆的形成也在发展中大脑，虽然主要区域导致这个转换过程，如海马和前额叶皮层，仍然相当不成熟的。事实上，皮层和海马结构的不成熟也可能意味着结构之间的不成熟和较不有效的沟通，因为它是通过睡眠期间SOs、纺锤波和涟漪的同步发生来实现的。在人类儿童，纺锤波的耦合与年龄增加，一起增加睡眠依赖记忆形成一夜之间，和7到15岁的儿童，近主轴耦合与隔夜记忆巩固正相关，也独立于孩子的年龄。然而，这些研究只包括学龄儿童和年龄较大的儿童，而且没有覆盖在表面脑电图中无法检测到的海马涟漪。

在这种背景下，目前的实验解决了这样一个问题：在睡眠中，纺锤波和海马波之间的耦合在多大程度上介导了睡眠中的系统巩固过程，已经在比先前的研究中检测的更早的发育阶段存在。因为我们特别感兴趣的海马涟漪的动态不能识别在人类表面脑电图记录，我们采用了老鼠模型允许同时记录SOs和纺锤波表面脑电图结合涟漪以及纺锤波在海马局部场电位（LFP）记录。

下面，我们报告了研究结果，在大鼠SWS期间记录了两次，即出生后（PD）26和PD32，即时间点大致对应于人类早期（1-2年）和晚期（9-10年）儿童（为大鼠和人类的年龄对应）。一群成年动物（14-18周，~22-29岁）作为参考（见方法，组和记录的详细描述和分析）。我们研究的一个主要发现是，纺锤波强耦合发生在发育过程中相当晚的时候，而在儿童时期的记录中没有检测到。我们将在主动系统整合概念的背景下讨论这些发现。假设这些睡眠振荡之间的耦合对于睡眠期间有效的记忆形成是必不可少的，这个概念似乎特别受到纺锤波耦合的挑战。

3. 材料和方法

3.1 动物和实验设计

实验是在八只年轻的雄性Long Evans大鼠（53-95克，25-32天大）上进行的，这些大鼠在PD26和PD32两次进行了实验记录。此外，还在五只成年大鼠（280-340克，14-18周大）上进行了记录，这些大鼠在PD120左右记录了一次。所有动物均由Janvier Labs（法国Le Genest St. Isle）提供。动物在12小时的光暗周期下饲养，光照时间为19:00，提供自由取用的水和食物。年轻和成年动物也在之前的实验中使用过（那些实验涉及不同的研究问题，其结果与本研究的结果没有任何冲突）。所有实验程序均获得了图宾根大学和负责动物福利的当地机构（图宾根政府主席）的批准。

3.2 手术植入

按照标准外科手术程序进行。动物通过腹腔注射芬太尼（0.005 mg/kg BW）、咪达唑仑（2.0 mg/kg）和美托咪定（0.15 mg/kg）进行麻醉。将它们放置在立体定位框架中，并在必要时补充异氟烷（0.5%）。暴露头皮并在颅骨上钻孔以植入三个EEG螺钉电极：一个额叶电极（成年动物：AP：+2.6 mm，ML：-1.5 mm，幼年：AP：+3.0 mm，ML：-1.5 mm，相对于Bregma），一个顶叶电极（成年：AP：-2.0 mm，ML：-2.5 mm，幼年：AP：-3.0 mm，ML：2.5 mm），和一个枕叶参考电极（成年：AP：-10.0 mm，ML：0.0 mm，幼年：AP：~ -10.0 mm，ML：~ -0.1 mm）。为了记录背侧海马（dHC）的局部场电位，植入了一个额外的电极（成年：铂，右侧，AP：-3.1 mm，ML：+3.0 mm，DV：-3.6 mm，幼年：不锈钢，左侧，AP：-3.0 mm，ML：+2.5 mm，DV：-2.5 mm）。在成年大鼠中，还在右侧内侧前额叶皮层植入了一个电极（此处未报告数据）。LFP记录也参考了枕叶螺钉电极。通过组织学分析确认电极位置（补充图S1）。为了进行EMG记录，在颈部肌肉中植入了一个不锈钢电极。电极连接到一个六通道电极基座（PlasticsOne，美国），并用冷聚合牙科树脂固定，伤口缝合。大鼠分别有至少3天（幼年）和5天（成年）的恢复时间。

3.3 电生理记录和程序

将年轻大鼠的睡眠记录在一个记录箱中（深灰色聚氯乙烯，30×30cm，高度：40cm），连续4天间隔两次3小时（醒来间隔5分钟）。在之前的清醒间隔中，年轻的老鼠可以自由地在一个开阔的田野里探索物体。在目前的分析中，我们使用了与动物的PD26和PD32对应的第一天和第四天的记录。在1天前接受手术的动物亚组中（即使用PD20而不是PD21），也提前1天进行了记录。为了简单起见，也由于探索性分析没有揭示这些动物的任何不同的动态，我们在所有病例中都提到了相同的时间模式，PD26和PD32表示实验记录的日期。成年大鼠接受相同的程序，除了3小时的睡眠间隔没有被5分钟的清醒间隔中断。所有的动物都习惯于使用录音盒至少2天，每天12个小时。所有的记录都发生在光照阶段（在早上7：30到下午3：30之间），同时使用摄像机连续跟踪动物的行为。使用CED Power 1,401转换器和Spike2软件（剑桥电子设计，英国）连续记录脑电图、LFP和肌电信号并进行数字化。在录音过程中，电极通过一个旋转换向器连接到放大器（型号15A54型，Grass Technologies，美国）。信号（所有在1 kHz采样）在0.1到300 Hz（EEG）和30和300 Hz（EMG）之间进行放大和滤波。LFP录音在0.1 Hz下进行高通滤波。

3.4 组织学

最后一次记录结束后，大鼠被芬太尼(0.01 mg/kg）、咪达唑仑（4.0 mg/ kg）和美托咪定（0.3 mg/kg）最终麻醉。电极位置用电解损伤进行标记。大鼠灌注生理盐水（幼龄大鼠50-100 mL，成年大鼠200-300 mL），然后灌注4%多聚甲醛（PFA，200-300 mL）。斩首后，取出大脑，用4% PFA固定1天。用振动仪切割60 μm的冠状面切片，用0.5%甲苯胺蓝染色，并在光镜下观察。由于电极定位不正确，来自3只幼龄动物的LFP数据不得不被排除在分析之外。

3.5 睡眠阶段分类

根据脑电图和肌电图记录离线确定睡眠阶段，使用前面描述的连续10秒周期的标准视觉评分程序。区分三个睡眠阶段：SWS、快速眼动睡眠和快速眼动睡眠。清醒通过混频脑电图和持续肌电活动来识别，SWS通过高振幅低活动（delta活动：<4.0 Hz）和肌电张力降低，低振幅脑电图活动(主要theta活动（5.0-10.0Hz），阶段性肌肉抽搐和肌电张力降低。PreREM表现为额三角活动的减少、theta活动的逐渐增加和睡眠纺锤波的存在。录音由两名经验丰富的实验者进行评分（评分者间一致性> 89.9%）。

3.6 检测SOs、纺锤波和波纹

在检测到事件相关电位之前，被伪影污染的周期（包括饱和的放大器通道）被丢弃。振荡目标事件确定脑电图和LFP使用标准程序如前所述：简而言之，识别，脑电图和LFP信号过滤0.3和4.5Hz，一个事件相关脑电图如果满足以下标准：(1)两个连续负正交叉信号发生在0.4和2.0秒之间，(2)一个大鼠和通道，选择两个零交叉之间负峰值最高的35%，(3)在这些事件中选择负到正峰的峰值最高的45%。在主轴检测中，脑电图和LFP信号在7.0~20.0Hz之间进行滤波。脑电图信号用于表征纺锤波和SO-纺锤波的共现和耦合，LFP信号用于分析海马网络中的纺锤波的共现和耦合。然后，提取滤波后信号上的希尔伯特变换的包络线，即瞬时振幅，然后进行额外的平滑（200毫秒窗口大小的移动平均值）。当在动物的SWS期内，当转换信号的绝对值超过各自通道中平均信号的1.5个标准差（SD）时，至少0.4秒且不超过2.0秒时，识别出主轴。主轴的开始被定义为信号第一次超过1.5 SD阈值的时间。纺锤振幅计算为希尔伯特变换信号包络的积分。为了计算希尔伯特变换。使用MATLAB函数abs提取包络线，它返回绝对值（模量），即转换信号的“瞬时振幅”。对于dHC LFP中的波纹检测，信号在150-250Hz之间进行滤波。为了确保去除纹波带中的任何技术伪影，在147-152、198-202和248-252Hz的范围内应用了三个额外的带阻滤波器。与主轴检测类似，我们计算了希尔伯特变换，并使用移动平均数（窗口大小为200毫秒）对信号进行了平滑处理。涟漪事件识别当平滑的希尔伯特变换值超过阈值2.5从过滤信号的动物的SWS时代，至少25毫秒（包括至少三个周期）和不超过500毫秒。

对于每个大鼠和记录过程，我们分析了不同的参数来评估SO、纺锤体和纹波事件。这些参数适用于SO事件：平均峰值振幅和密度（每分钟SWS）；对于主轴事件：振幅（由滤波后的脑电图/LFP信号平滑的希尔伯特变换曲线下的面积定义）、密度（每分钟）、平均振荡频率和持续时间；对于波纹，振幅（由滤波后的LFP信号平滑的希尔伯特变换曲线下的面积定义）、密度（每分钟）、平均振荡频率和持续时间。

3.7 振荡事件的共现和锁相

为了分析SOs、纺锤波和波纹之间的时间关系，我们确定了在SO事件中发生的纺锤波事件的数量和在纺锤波事件中发生的波纹的数量。如果主轴振荡的最大值发生在SO的开始和偏移之间（由信号各自的零交叉定义），则主轴被视为与SOs同时发生。如果整个纹波事件发生在纺锤体期间，则纹波被视为与纺锤波同时发生。

为了补充事件的共现，我们计算了“首选周期相位”，作为纺锤与SO事件的精确相位叠加的测量，以及波纹与纺锤振荡的耦合。为了确定SO-纺锤体相位耦合，原始脑电图信号在0.6-1.8Hz之间进行滤波，以解释SOs的不对称形状。目视检查证实了结果信号的接近正弦形状，以及平滑信号的相位与原始信号的对应关系（图1A）。然后，对滤波波形计算希尔伯特变换，提取SO在主轴最大值处的瞬时相位。相应地，为了确定纺波耦合，对7~20Hz的原始LFP信号进行滤波，计算每个伴随纹波的主轴的希尔伯特变换，提取纹波最大值时主轴的瞬时相位。

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图1. 不同年龄段的睡眠振荡特征。(A)从顶叶脑电图（实线）获得的平均SOs时间锁定到下行状态峰值（0 ms）。虚线表示用于确定so-纺锤耦合相位的平均滤波波（0.6-1.8Hz）。浅音表示PD26，中音表示PD32，暗音表示PD120。(B)平均± SEM SO峰对峰振幅和(C)密度（/min SWS）。(D)来自顶叶脑电图的最大峰值（0 ms)。(E)平均± SEM主轴振幅、(F)密度（/min SWS）和(G)振荡频率。(H)来自海马LFP记录的平均纹波（时间锁定到最小峰值，0 ms）。(I)平均± SEM纹波振幅。额叶脑电图-粉红色，顶叶脑电图-绿色，海马体LFP-橙色。** p < 0.01，* p < 0.05，为年龄之间的两两比较，## p < 0.01，# p < 0.05，为额叶和顶叶记录之间的两两比较。

我们对相位采样分析进行了两次控制分析：由于应用于单个事件的希尔伯特变换会引入边缘效应，从而导致相位角的偏差确定，因此我们基于全带通信号的希尔伯特变换进行了控制分析。这些分析表明，由希尔伯特变换引入的边缘效应仍然是边缘的，并且没有任何偏置相位角估计。另一个可能导致不准确的相位估计的因素是使用相当宽的频带来进行耦合分析。因此，由于我们对主轴事件的相位耦合分析依赖于相当宽的（7-20Hz）频带，我们将频带划分为子带后进行了控制分析，即7-10、10-12、12-14-14、14-17和17-20Hz。然后，对于每个单独的主轴事件，选择相应的滤波频率子带来提取相位。这些分析的结果与基于最初更宽的7-20hz频带的分析结果相同。

3.8 统计分析

使用定制编写的MATLAB脚本进行统计分析。为了评估SO、纺锤波和纹波特征及其共现的差异，我们使用方差分析（方差分析），包括组间因素“年龄”（儿童早期、儿童晚期和成年），对于脑电图参数，“拓扑”（额叶、顶叶）作为重复测量因素。方差分析之前进行Levene方差相等检验，以确保满足同方差假设。方差分析之后进行两两重复测量（用于儿童早期和晚期之间的比较）或独立样本t检验（用于与成人组的比较）。另外的方差分析包括一个因素“间隔”，反映了对于所有的动物，都获得了两个单独的3小时间隔的记录。由于这些分析没有显示任何显著的间隔-主效应或交互效应，因此这里只报告来自两个记录间隔的数据折叠的结果。对于锁相分析，我们使用瑞利测试，作为一个额外的，更自由的测试，也包括双和多模态分布测试确定慢振荡和主轴振荡的相位(s)。因为在我们报告的案例中（即<0.45），合成的矢量长度太小，所以无法应用沃森-威廉姆斯测试来检验耦合的平均相位角的差异（由合成向量反映），我们使用了非参数方法，即等中值方向的多样本检验，这是多样本克鲁斯卡尔-沃利斯检验的圆形模拟，以检验中值方向的差异。

4. 结果

4.1 年龄对SOs、纺锤波和涟漪特征的影响

在3小时的记录间隔中，睡眠时间和不同睡眠阶段在所有年龄段大致具有可比性（p > 0.07，所有参数），所有动物大部分时间花在SWS（177.01 ± 9.65分钟，跨年龄，补充表S1）。表1总结了目标振荡事件的特征

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所以振幅高于额叶脑电图（F（1，36）= 14.05，p < 0.001，“拓扑”主效应），并增加从儿童早期（PD26）最大值在儿童后期（PD32），然后再次减少到成年(图1（F（2，36）= 8.28，p < 0.005，年龄主影响，图1B，两两比较年龄和额叶和顶叶脑电图）。因此，密度（每分钟SWS）在顶叶上同样高于额叶皮层，这种效应在儿童早期最为显著（PD26，F（1, 36）= 15.21，p < 0.001，“拓扑”主效应，图1C）。年龄对SO密度没有一般的影响（p > 0.09）。

从PD26到PD32，额叶和顶叶脑电图的主轴振幅（确定为脑电图曲线下面积）均增加（F（2, 36）= 5.3，p < 0.01，图1E）。纺锤体密度的平行增加（F（2, 36）= 5.26，p < 0.01）在额叶记录中似乎更一致，其中纺锤体密度通常高于顶叶记录（F（1, 36）= 131.19，p < 0.001，对于“拓扑”主效应，图1F）。在PD26的儿童早期，顶叶的主轴频率明显高于额叶记录部位（图1G）。在额叶部位，纺锤体频率在儿童期（PD32）和成年期期间增加，因此在成年大鼠中，纺锤体频率具有可比性（F（2, 36）= 11.82，p < 0.001，对于年龄ד拓扑”交互作用）。

从PD26到PD32，海马波纹在密度、频率和持续时间上没有显著变化（所有相关的两两比较p > 0.08，表1）。与成年大鼠（PD26和PD32）相比，其涟漪振幅降低（F（2, 12）= 10.08，p < 0.01，作为年龄的主要影响因素，图1I）。

4.2 SOs和纺锤体之间的时间关联

我们计算了与SOs同时发生的纺锤体的数量以及SO-纺锤体事件的百分比，并参照了已识别的SOs的总数（设置为100 %）。SO-纺锤体事件多发生在额叶脑电图（F（1, 36）= 9.53和27.84，p < 0.01，对于SO-纺锤体事件的绝对数量和百分比）。从儿童早期（PD26）到儿童晚期（PD32），so主轴事件的绝对数量和百分比均增加，到成年期（PD32）进一步增加（F（2, 36）= 42.6和22.6和27.50，p = 0.001，各自年龄的主要影响见图2A两两比较）。特别是在SO-纺锤体事件的百分比方面，年龄相关的额叶增长比顶叶皮层更明显（F（2, 36）= 4.04，p < 0.05，年龄ד拓扑”交互作用）。当SO-纺锤体事件以识别纺锤体的百分比表示时（F（2, 36）= 42.6, 27.6, 20.36, 20.36，p=0.001, 额叶和顶叶的年龄主效应），随着年龄的增长同样明显。SO-纺锤体事件的绝对数量和百分比与SO-纺锤体事件的增加同样明显，表明SOs和纺锤体共现的增加完全独立于振荡本身密度的变化。它反而表明，随着年龄的增长，一种更有效的将SOs和纺锤波暂时配对的方式出现了。

为了更精确地评估纺锤在SO过程中发生的时间点，我们确定了纺锤被时间锁定的SO周期的阶段。图2B描述了主轴事件相对于SO周期相位的归一化角直方图，平均圆向量的长度和相位角表示耦合强度，即耦合强度的一致性在所有个体动物的所有SO事件中，纺锤体结合到某个SO阶段。平均圆形向量表明显著的相耦合轴的北部确定SOs在所有年龄段，即平均21°在PD26， 22°在PD32和351°在成年老鼠（p < 0.001）。各年龄组间矢量相位角的差异没有达到显著性（p = 0.062，对于圆形模拟的Kruskal-Wallis检验）。额叶脑电图在儿童后期(PD32（平均<0.001）和成年大鼠（瑞利检验平均<0.001），但在儿童早期PD26（瑞利检验为0.26；p = 0.3824，双和多模态分布的综合检验为0.4982），表明在额叶皮层SO和丘脑纺锤波之间的交叉频率耦合的发展是长期的。PD32与成年大鼠之间的矢量相位角差异不显著（p = 0.1974）。

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图2. 不同年龄段纺锤体与SOs的共现和相位耦合。在额叶（粉色）和顶叶（绿色）脑电图记录部位，与SO和SO主轴事件的绝对数（左）相对于已识别SOs总数的百分比（右）。** p < 0.01，* p < 0.05，在年龄之间的两两比较，## p < 0.01，# p < 0.05，在额叶和顶叶脑电图记录之间的两两比较。(B)圆形直方图显示，对于三个年龄和额叶（上行）和顶叶脑电图信号（下行），纺锤体（最大值）发生时的SO的相位角分布。平均圆矢量的方向和长度（黑色）表示耦合强度，即纺锤体与一定年龄受试者SOs的相位耦合的一致性。通过单峰分布的瑞利检验，表明了so-主轴相位耦合的显著性（p < 0.0001）。除了PD26（儿童早期）的额叶皮层上的记录外，相位耦合在所有年龄和所有的记录部位都是显著的。

4.3 纺锤体和海马体涟漪之间的时间关联

我们集中分析了纺锤波纹事件，在海马LFP信号中发现了类似波纹的纺锤波。到达海马网络后，这些LFP纺锤体被认为是最强烈的耦合海马涟漪。纺锤体在儿童早期（PD26）期间同时出现的涟漪数量没有变化，但在成年期显著减少（图3A）。这个模式观察无论绝对数量的纺锤波事件（F（2，12）= 5.13，p < 0.05，年龄效应），百分比参照主轴的总数（F（2，12）= 5.52，p < 0.05）或百分比参照总数检测到的涟漪被分析（F（2，12）= 5.92，p < 0.05）。因此，成年期纺锤波事件的减少与纺锤波或波本身发生的任何年龄相关的动态无关。这与SO-纺锤体事件在成年期的明显增加形成了显著的对比（图2A）。显著减少从儿童（PD26、PD32）到成年的分析只发生主轴涟漪事件，即发生在额或顶叶脑电图记录（F（2, 24）=5.53，p<0.05）。

我们计算了归一化（在主轴振荡中发生的波纹总数）相位直方图，以量化主轴振荡中发生的波纹在多大程度上与主轴振荡的特定相位耦合（图3B）。在这些分析中，纹波发生的时间由纹波的最大峰值表示。在成年大鼠中，波纹与纺锤振荡呈显著的相位耦合，平均角度为329°（p < 0.001），与纺锤振荡的下流态转变相对应。相比之下，在儿童时期，PD26（p = 0.97）或PD32（p = 0.96）上的纺锤体振荡没有表现出任何显著的相位耦合。在PD26和PD32个体的单组分析中（所有p > 0.1）中，任何幼龄大鼠中也没有显著的纺锤波纹相位耦合。

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图3. 波纹与纺锤波的共现和相位耦合。(A)平均±SEM纺锤波事件的绝对数量（左）和纺锤波事件的百分比相对于识别纺锤波总数（中）和识别波波总数（右）。在海马的LFP中发现了纺锤体和涟漪。** p < 0.01，* p < 0.05，为年龄之间的两两比较。(B)圆形直方图显示了三个年龄内发生波纹的主轴振荡的相位角分布。平均圆形矢量的长度（黑色）表示耦合强度，即在一定年龄的所有纺锤波和大鼠的波纹与纺锤波的相位耦合的一致性。这个圆的参考长度为0.01。瑞利检验表明了主轴-纹波相位耦合的显著性（p < 0.0001）。显著的纺锤波纹相位耦合只存在于成年大鼠中。在圆形直方图旁边，显示了平均纺锤波事件。

5. 讨论

我们研究了PD26和PD32大鼠早期发育期间的睡眠SOs、纺锤波和波纹及其时间耦合，大致相当于人类早期（1-2岁）和晚期（9-10岁）儿童。我们发现SOs和纺锤波有不同的发育过程，都在儿童后期达到最大振幅，纺锤波主要在额叶皮层区域显示振荡频率增加，并延伸到成年。海马涟漪的特征在儿童早期和晚期保持显著稳定，但在成年时振幅增加。重要的是，我们观察到这些振荡事件之间的共现和耦合的明显变化，这些振荡事件与这些事件中观察到的发展变化无关。so-纺锤体事件的数量在儿童期和成年期期间进一步增加。在所有年龄层，纺锤体与SO向上状态始终是相位耦合的，除了在儿童早期，在额叶皮层的记录中没有发现相位耦合。与SO-纺锤事件的发育动态不同，纺锤波事件的数量在儿童测量中没有变化，但在成年期明显减少。尽管在成年期出现了下降，但交叉频率耦合分析显示，只有在成年大鼠中，涟漪与纺锤体振荡的相位耦合显著增强，但在任何儿童期的测量中都没有。总的来说，这些研究结果表明，在发育过程中，有效的同步信息处理在丘脑皮层网络中明显早于在海马和丘脑皮层网络之间的实现。

在我们的大鼠中观察到的SOs和纺锤体中心特征的发育变化，与在人类早期发育过程中看到的类似变化相似。对于SOs，我们发现在儿童期振幅增加，在儿童后期（PD32）达到峰值，在成年期振幅下降。不仅在其他啮齿动物研究中观察到非常相似的发育过程，并且在儿童后期具有最大的SO振幅，而且在人类发育研究[39]中也观察到SOs和相关的慢波活动。因此，我们的大鼠顶叶的振幅高于额皮层脑电图记录，这可能反映了大鼠的额叶皮层相对较小，而人类通常在额叶皮层上表现出更高的SO振幅。在儿童时期的测量中，大鼠的密度没有明显的变化。SOs的变化，特别是在儿童后期的SO振幅的峰值，与底层皮层网络中突触连接的变化有关。鉴于SO振幅与突触密度呈正相关，在儿童后期达到的最大振幅可能反映了发育性突触发生同时达到最大值。

至于丘脑皮层纺锤波，我们发现在儿童期和成年期，振荡频率显著增加，特别是额叶皮层的纺锤波，在儿童时期通常也比顶叶皮层的纺锤波慢。这种模式也与人类的研究结果一致，即在（早期）儿童时期的以及从儿童时期到青少年时期的中，纺锤体频率增加。我们在大鼠身上的模式似乎也与人类的研究结果相一致，即额叶纺锤波在青春期期间的振荡频率突然增加，然后在成年后趋于稳定。此外，在我们的儿童测量中，额叶纺锤波振幅增加，随后在成年期下降，这与人类的发育模式相似，即额叶纺锤波振幅仅在青春期开始后下降。最后，与人类的发展非常相似，我们的大鼠的纺锤体密度在整个儿童时期（从PD26到PD32）都增加了，这种增加在额叶皮层比顶叶皮层更明显。本研究中大鼠和人类的发现之间纺锤体发育的差异似乎主要与顶叶皮层的记录有关。因此，与人类显示中心顶叶纺锤体的振荡频率发育增加不同，在我们的大鼠中，顶叶纺锤体的频率没有随年龄而变化。此外，与大鼠儿童时期顶叶纺锤体振幅的明显增加相比，人类儿童时期顶叶纺锤体振幅的变化似乎是边缘显著的。这些差异的原因尚不清楚，但可能与人类比啮齿动物有更多的白质以及啮齿动物的白质比人类发育更快有关。无论如何，总的来说，大鼠的变化模式与人类儿童时期额叶皮层纺锤体发育的相似之处，重要的是，暗示了额叶和顶叶皮层纺锤体的不同发育过程，这在人类中同样观察到。一个有趣的但开放的问题在这种情况下是在多大程度上这些差异发展纺锤波额叶和顶叶皮层对应的分离所谓的“慢”和“快”纺锤波观察在成年人和老鼠，不仅显示类似的地形分离（额叶和顶叶），但在功能也不同。总的来说，人类和大鼠在儿童时期的纺锤体发育之间的许多相似性强调了我们的大鼠模型在探索感兴趣的睡眠振荡事件的发育变化方面的有效性。

海马体的涟漪目前还不能通过无创脑电图或脑磁图记录来可靠地测量，这限制了人类对其发育过程的直接探索。对啮齿动物的研究主要集中在比本研究更早的出生后年龄范围，表明纹波幅度、密度和持续时间已经通过PD24达到成人样水平，即在本研究感兴趣的儿童年龄范围之前。涟漪的时间过程出现在这些早期PD似乎与极性开关（从膜去极化和超极化）GABA-A受体激活的影响，以及协调海马回放神经元放电模式，伴随这些涟漪和被认为是一个主要机制驱动记忆在睡眠中巩固。符合纹波发展已经在PD24附近水平的观点，我们只发现了边缘显著和完全不显著的变化，例如，在儿童测量中，纹波频率的轻微增加和纹波密度的下降。鉴于有证据表明，在整个儿童和青少年时期，海马抑制性和兴奋性突触传递和持续的神经发生的持续变化，这可能令人惊讶。我们确实观察到成年期的纹波振幅明显增加，这表明这种变化在突触和回路水平的可能积累较长的时间，最终在青春期或成年早期的网络水平上表达。

SOs、纺锤波和涟漪的时间耦合被认为是一种将海马网络中情景记忆信息的重放与丘脑皮层网络中的记忆处理联系起来的机制，从而促进了海马重放信息与新皮层长期存储的整合。在此背景下，我们研究的中心目的是探索纺锤体之间以及纺锤波之间的时间关联的发展，分别反映丘脑皮层系统和海马和丘脑皮层网络之间的记忆处理效能。值得注意的是，我们观察到在儿童期和成年期，两种纺锤体与SOs以及波纹的共现和相位耦合发生了明显的发育变化。额叶SO-纺锤体耦合从儿童早期到晚期增加，而显著的纺锤体-波纹耦合仅在成年期才被发现。重要的是，分析了绝对事件数或各自事件的百分比（如SO-纺锤波的总数），表明观察到的事件之间的时间关联的发展变化基本上独立于每个单一振荡事件发生率的变化。

在我们的大鼠中，从儿童早期到后期SO纺锤体事件和相位耦合强度的增加与人类的证据一致，表明从2到5岁，睡眠脑电图一致性的区域和频率特异性增加。在年龄较大的学龄儿童（9-16岁）中，SO-纺锤体耦合强度随着年龄的增长而增加，同时夜间记忆增加了。因此，结合这些和目前的研究结果，表明有效的so-纺锤轴耦合的发展有一个相当长的时间过程，一方面，在青春期之前并没有达到平台期，另一方面，在儿童早期就已经开始了。在我们的大鼠中，在最早的时间点（PD26），额叶皮层上缺失了显著的SO-纺锤体相位耦合，这与额叶皮层与更多的后皮层相比表现出长期的发育相一致。在这个年龄，纺锤体与SO向上状态的较弱耦合可能反映了丘脑-额皮质纤维的延迟骨髓化，尽管其他因素，如GABAergic系统的长期发展延伸到青春期晚期，也可能有贡献。

与SO-纺锤波事件不同，纺锤波事件的数量在儿童时期保持在稳定水平，在成年期明显减少。成年后的这种下降同样明显的是三次同时出现的波纹。与此同时，在儿童早期和后期的测量中，波纹与纺锤体振荡没有显著的相位耦合，但有趣的是，在成年大鼠纺锤体波纹事件数量大大减少的背景中出现了。因此，尽管在儿童时期，更多的涟漪与纺锤波同时发生，但只有在成年期，这种同时发生才是同步的，因此涟漪与纺锤波振荡的首选阶段稳定耦合。似乎在成年期，有效的海马体到丘脑皮层的信息传递，并最终将各自的信息整合到长期记忆中，所需要的事件对较少。此外，海马体涟漪与纺锤波之间的时间关联在儿童时期相当稳定，但只有在成年时期才会发生明显变化，这表明海马体和丘脑皮层网络之间有效的跨区域交流的发展相当延迟，并一直延伸到成年早期。

振荡事件之间的交叉频率耦合被认为是一个最接近地反映网络之间优化的信息传递的指标。如果是这样，这样的话，在儿童早期和晚期测量中，早期存在纺锤相耦合以及持续缺乏显著的纺锤波相耦合，表明海马和丘脑皮层网络之间的区域间通信在生命中成熟得明显晚于在丘脑皮层网络中成熟的时间。然而，考虑到我们研究的局限性，我们必须注意不要过早得出结论。我们的研究的统计能力有限，因为我们的幼年大鼠样本规模相当小，此外，它们被保存在标准的动物设施中，即在贫困刺激的条件下。先前的研究表明，将幼鼠暴露于空间经验中会加速发育过程中与睡眠相关的纺锤波纹耦合的出现。因此，本研究可能高估了在发展过程中不同的纺锤波纹相位耦合出现的延迟。这里需要考虑的另一点是，我们使用枕骨螺钉电极作为参考的海马LFP记录。这种方法倾向于检测在网络中显著扩散的更大的纹波事件，对年龄相关因素的混杂影响很敏感，如大脑大小和海马大小的差异以及参考电极下的颅骨厚度的差异。然而，尽管这些因素可能有有偏差的纹波振幅测量，但它们不太可能显著影响纺锤波和波纹之间的耦合和相位关系，即在相同的记录条件下测量的事件。此外，进一步排除海马内电极的差异混淆了观察到年龄对海马涟漪的影响，在补充分析我们比较影响的两个电极最佳匹配位置在两个年龄组以及两个电极显示最大的位置组之间的差异。两项比较都证实了整个组的模式，这在很大程度上排除了不同年龄组之间电极位置差异的混杂效应。

我们研究的进一步限制是缺乏任何记忆的行为测量。有强有力的证据表明，海马涟漪以及纺锤体与SO- upstate的耦合对记忆巩固有因果关系。相比之下，精确的纺锤波纹相位耦合对记忆巩固的因果贡献主要是基于概念上的考虑。目前，不能排除这种耦合在发展过程中作为一种附带现象出现，没有行为相关性。要证明纺锤波-波纹波耦合的因果作用，需要对事件之间的相位耦合进行实验操纵，这目前很难实现，但可能在未来基于振荡事件的光遗传诱导的研究中取得成功。

总之，在本研究中，在发育中的大鼠中，我们无法在PD26处检测到强大的额皮质SO-纺锤体耦合，并且在儿童时期的PD26和PD32这两种测量方法中也没有显著的纺锤体-纹波耦合，其在早期发育过程中的确实，可以被认为是参与结构之间沟通不成熟的标志，即SO-纺锤体耦合情况下的丘脑皮层系统，以及纺锤体-纹波耦合情况下的丘脑皮层系统与海马体之间。鉴于充足的证据表明，记忆巩固大量利润从睡眠也在儿童和婴儿，缺乏健壮的主轴波耦合在儿童测量甚至可能采取问题的主动系统巩固概念认为海马丘脑皮层信息传递的关键机制支持记忆巩固在睡眠。早期发育的条件可能会有所不同，因为仅仅是纺锤波和波纹的时间共现，而没有精确的相位耦合，就足以实现有效的巩固。

参考文献：Sleep-slow oscillation-spindle coupling precedes spindle-ripple coupling during development.