ABPP 化学蛋白质组学经典文献解读：二甲双胍靶点筛选及验证

一

ABPP 技术介绍

基于活性的蛋白质谱(activity-based protein profiling，ABPP)是一种化学蛋白质组学方法，它结合基于活性的探针(activity-based probe，ABP)和蛋白质组学技术来鉴定活性小分子的蛋白质靶标，以帮助阐明活性小分子发挥作用的机理。

二

ABPP 主要实验步骤

1. 探针制备：活性分子探针的设计合成，以及探针活性鉴定

2. 将探针与总蛋白孵育（或与细胞孵育后提取总蛋白）

3. 上述孵育完成后，先后进行 UV 照射（使活性分子与靶蛋白共价相连）、 点击化学反应（给活性分子引入报告基团，如生物素）

4. 通过报告基团对靶蛋白进行富集鉴定

ABPP 实验基本流程图

三

高分文章案例分享

Nature | 厦门大学林圣彩院士团队和邓贤明团队基于化学探针法找到了二甲双胍的分子靶点——PEN2

二甲双胍（Metformin，化学式C4H11N5）是一线治疗2型糖尿病的药物，并在预防糖尿病患者发生癌症和心血管疾病并发症方面具有重要作用，尽管如此，二甲双胍的具体药理机制尚不完全明确，其用于治疗2型糖尿病的分子靶点仍不清楚，具体由哪些分子介导仍需进一步研究。在已确定的二甲双胍的各种潜在效应物中，代谢稳态的主要控制器单磷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）被置于中心位置，二甲双胍可激活腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK），这是二甲双胍抑制糖异生并提高胰岛素敏感性的重要机制之一。但二甲双胍如何激活 AMPK 及其直接靶点仍有待进一步阐明。

2022年2月24日，厦门大学生命科学学院的林圣彩院士团队和邓贤明院士团队合作在 Nature 上在线发表了题为“Low-dose metformin targets the lysosomal AMPK pathway through PEN2”的研究论文，该研究通过合成二甲双胍的化学探针 (Met-P)，在探针的前端为二甲双胍，后端则是一个生物素标签，通过对细胞中“钓”出的20000多种可能与二甲双胍结合的蛋白，并通过质谱等手段分析鉴定，最终确定二甲双胍通过与  PEN2 蛋白的互作介导 AMPK 的激活发挥药效。

研究思路小结

01

二甲双胍与 PEN2结合

1.1 临床剂量二甲双胍抑制溶酶体液泡中 v-ATP酶

人们普遍认为二甲双胍 (Metabolic) 通过抑制线粒体电子传递链复合物I激活 AMPK，损害 ATP 的合成，进而增加 AMP/ATP 和 ADP/ATP 的比值。已有的研究表明二甲双胍能通过抑制溶酶体上的液泡  v-ATP酶，触发 AXIN 和 LKB1 向溶酶体转移，进而导致 AMPK 的激活。本研究中，作者发现临床剂量（低剂量）的二甲双胍能抑制液泡 v-ATP酶并激活 AMPK，却并不增加  AMP/ADP 水平（图1）。

图1 ABPP 实验基本流程图

1.2 探针筛选二甲双胍直接靶点

作者首先通过取代反应将光交联基团与二甲双胍结合，引入二甲双胍的 N4 或 N1/N2 位置的二唑啉，产生两种光敏 Met-P 探针（Met-P1和Met-P2），合成方法如图2f所示。

随后作者使用合成的 Met-P1 探针垂钓靶点蛋白。大致实验流程如下：Met-P1 与溶酶体裂解物共孵育，并通过紫外照射将 Met-P1 与溶酶体蛋白质化学结合，再通过点击化学 CuAAC 对其进行生物素化，然后使用 NeutrAvidian 树脂进行 Pull down 以纯化与探针 Met-P 结合的蛋白，最后通过质谱分析鉴定蛋白种类（图2a），从3042个溶酶体驻留蛋白中筛选到367个可结合 Met-P1 蛋白，后续通过单独表达鉴定到其中113个蛋白在 HEK293T 细胞中单独表达时能被 Met-P1 拉下。随后通过 shRNA 逐一沉默 MEF 细胞中这113个蛋白，最终鉴定到 PEN2 蛋白的沉默阻断了低剂量二甲双胍诱导的 AMPK 活化和 v-ATP酶抑制（图2b，2c）。随后通过激光共聚焦实验（图2d）和基于 APEX 标签的投射电镜（图2e）显示 PEN2 蛋白定位于溶酶体中。

图2 二甲双胍光敏探针合成及探针筛选二甲双胍靶蛋

白 PEN2

1.3 PEN2 蛋白与二甲双胍的直接互作

为进一步探究 PEN2 与二甲双胍的生物物理学性质，作者通过差示扫描量热分析（图3a）表明 PEN2 在与二甲双胍存在时出现热偏移，提示 PEN2 结合二甲双胍时发生构象改变，随后采用等温滴定量热法（ITC）和表面等离子共振测得二甲双胍与 PEN2 蛋白的平衡解离常数KD分别为1.7 μM （图3b）和0.15 μM （图3c）。ITC 实验结果表明二甲双胍与 PEN2 有额外的结合位点，第二位点的平衡解离常数达到98 μM。

图3 PEN2 蛋白与二甲双胍互作检测

1.4 PEN2 与二甲双胍互作的关键氨基酸

为进一步探究二甲双胍与 PEN2 蛋白的互作位点，作者通过质谱鉴定了 Met-P1 纯化的 PEN2 蛋白以确定 PEN2 负责结合二甲双胍的氨基酸。确定了 PEN2 的 N 末端氨基酸 Y47 参与了 PEN2 与二甲双胍的结合，表明二甲双胍可能结合 PEN2 蛋白的氨基酸末端（图4a）。通过计算模拟分析表明，PEN2 的 N-末端区域，二甲双胍通过 PEN2 的 F35 和 E40 残基与 PEN2 蛋白形成互作（图4b）。通过 Pull down 和 SPR 实验鉴定到 F35A 和 E40A 的双丙氨酸突变 PEN2-2A 无法与二甲双胍结合（图 4c），表明 F35 和 E40 是参与二甲双胍结合 PEN2 蛋白的关键氨基酸。

图4 PEN2 参与二甲双胍互作的氨基酸鉴定

02

ATP6AP1 将 PEN2 连接至 v-ATP酶

为探究二甲双胍如何导致 PEN2 与 v-ATP酶互作并抑制 v-ATP酶，作者通过质谱分析了与溶酶体蛋白提取物共孵育后免疫共沉淀的 PEN2，在检测到的1881中蛋白质中有889种在二甲双胍治疗后发生变化，在889种蛋白中有123种是溶酶体驻留蛋白，其中 ATP6AP1 是其中一种溶酶体驻留蛋白，并且 ATP6AP1 是 v-ATP酶的的辅因子之一。作者对通过免疫共沉淀证实了 ATP6AP1 与 PEN2 的二甲双胍依赖性相互作用（图5a-c）。基于计算模拟对接试验和试验证明，PEN2-20A 突变削弱了 PEN2 与 ATP6AP1 之间的相互作用（图 5d, e）。这些数据表明在与二甲双胍结合后，溶酶体 PEN2 被募集到 v-ATP酶复合物的 ATP6AP1 上。

图5 ATP6AP1 将 PEN2 连接到 v-ATP酶以激活 AMPK

03

PEN2 和 ATP6AP1 在动物模型中的表型

在后续的实验中，作者在动物模型中探讨了 PEN2 和 ATP6AP1 在二甲双胍功能中的介导作用。结果显示，小鼠肠道特异性 PEN2 敲除（PEN2-IKO小鼠）显著削弱了二甲双胍的降糖效果，并且二甲双胍对 GLP-1 和胰岛素分泌的促进作用也受到显著影响（图6a，b）。此外，肝脏特异性 PEN2 敲除小鼠（PEN2-LKO 小鼠）在肝脏中 AMPK 的活化受到严重损害。长达四个月的二甲双胍给药实验显示，PEN2-LKO 小鼠在高脂饮食诱导的肥胖模型中，二甲双胍降低甘油三酯水平和改善葡萄糖耐受的效果也明显减弱（图6c，d）。这些结果表明，PEN2 和 ATP6AP1 在通过激活溶酶体 AMPK 途径减少肝脏脂肪的过程中，对二甲双胍的疗效起着至关重要的作用。

图6 PEN2 和 ATP6AP1 在二甲双胍的生物学效应中起着关键作用

在这篇文章中，作者鉴定了 PEN2 蛋白作为二甲双胍的直接靶标。研究表明，在低浓度二甲双胍的刺激下，PEN2 与 ATP6AP1 结合，从而抑制 v-ATP酶的活性。此过程随后激活 AMPK，使得低浓度的二甲双胍能够通过不依赖 AMP 的途径激活 AMPK 信号通路（图7）。这一发现揭示了二甲双胍在细胞代谢调节中的新机制，扩大了我们对二甲双胍作用方式的理解，并为未来开发更有效的代谢疾病治疗策略提供了新的视角。通过深入解析这一信号通路，本文为代谢调节和相关疾病的研究提供了重要的理论基础和潜在的应用前景。

图7 二甲双胍激活 AMPK 信号通路机制

佰莱博生物提供生物物理、生物化学、细胞生物学及计算机模拟等多个层面分子互作筛选及验证服务。主要技术平台包括：SPR、MST、ITC、BLI、DSF、Small Pull-Down、小分子免疫荧光（小分子荧光共定位）、Target engagement (TE) assay、CETSA、GST Pull-Down、Co-IP 等分子互作验证技术；配体垂钓、化学蛋白质组学（ABPP）、CETSA-MS、DARTS-MS、体外药筛 (AlphaScreen、ADP-Glo、TR-FRET) 等分子互作筛选技术；化合物合成及探针制备、生物偶联、蛋白表达纯化等生物活性分子制备技术；高内涵细胞成像与分析(HCS，High-content screening)、Incucyte长时间活细胞成像分析、酶联免疫斑点技术 (ELISPOT)、Luminex液相悬浮芯片等细胞分析技术；nanoDSF、MALS (动静态光散射)、AUC (分析型超离)、CD (圆二色光谱技术) 等生物分子表征技术；计算机模拟 (分子对接、虚拟筛选、反向找靶、分子动力学模拟) 等生物信息学技术。提供生物分子互作分析、靶点筛选、药物筛选、化合物合成及生物偶联、蛋白表达纯化、细胞因子检测、生物大分子表征及制剂筛选等实验服务。

目前，佰博莱生物分子互作平台已经完成了1500多种蛋白的分子互作检测实验。针对热门医药研究靶点如：T 细胞的主要免疫调节因子 (Gal-1，Gal-3和Gal-9)、与糖尿病相关的胰岛素受体 (IR-A、IR-B、IGF-1R)、GLP-1R 等、血管内皮生长因子 (VEGF 121、VEGF165)、免疫球蛋白 Fc 受体 (Fcγ RI、Fcγ RIIB、Fcγ RIIIA、不同种属的FcRn) 、免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子 (Nectin-1，Nectin-2，Nectin-3，Nectin-4) 及整合素家族 (aVβ5、ITGB1、aVβ3等) 等重要靶点已具备成熟检测方法。