MST应用案例分享：验证蛋白与离子结合

介绍

微量热泳动技术(MST)通过检测Target(荧光标记的分子)与ligand分子(与之互作的分子)结合后形成的复合体在温度梯度场中泳动速度的变化，检测分子间结合的亲和力。分子在温度梯度场中的泳动速度与分子的大小、水化层及电荷情况有关。

MST技术不受互作的两个分子间的分子量比值大小限制，小至离子，大至超大蛋白复合物，均可获得高信噪比结果，离子与蛋白的互作也可以轻松检测。

而表面等离子共振技术 (SPR)、生物膜表面干涉技术(BLI)是基于结合后质量或者厚度的改变从而实现分子间互作检测的，离子的分子量极小，例如，Ca2+仅有40 Da，与常规蛋白的分子量差别在几百至上千倍，因此不能使用SPR或者BLI技术检测离子与蛋白间的相互作用。

虽然ITC技术也能用于研究部分离子与蛋白间的互作，但是部分金属离子(如铜离子等)与样品池金属材质发生反应，不能采用ITC技术进行检测。而MST技术相较于ITC技术，没有上述限制，同时消耗的蛋白样品更少一些，检测离子与蛋白互作更具优势。

01►

MST技术检测蛋白与钙离子互作（玉米）

干旱胁迫是影响主要粮食作物玉米减产的最大因素，开展玉米耐旱机制的研究对于提高农作物产量有着重要意义。干旱可快速诱导植物激素ABA的积累，并触发快速的钙信号响应，从而使植物合理应对干旱胁迫。钙依赖性蛋白激酶（CDPKs/CPKs）是植物主要的钙传感器之一，广泛参与包括干旱响应在内的多种生理过程。

中国农业大学巩志忠教授团队在期刊《Journal of Integrative Plant Biology》(一区，IF 9.3)上发表了题为“Ca2+-independent ZmCPK2 is inhibited by Ca2+-dependent ZmCPK17 during drought response in maize”的研究论文。该研究提出，在正常情况下，ZmCPK2可以磷酸化ZmYAB15从而启动下游靶基因 (e.g. ZmSTRK1) 的表达，维持植株正常生长发育；在干旱胁迫条件下，ABA及Ca2+激活ZmCPK17，活化的ZmCPK17通过磷酸化抑制ZmCPK2进而抑制ZmYAB15，启动植物对干旱胁迫的响应。

因ZmCPK2不依赖钙离子，但其活性受ABA调控，间接依赖于钙离子。研究者推测，干旱胁迫下，ZmCPK2可能受到其他钙响应上游蛋白激酶直接调控。研究发现ZmCPK17可与ZmCPK2直接相互作用，进而抑制ZmCPK2活性。为了确认ZmCPK17是否可直接响应钙离子，研究人员通过微量热泳动技术(MST)实验发现：ZmCPK17具有很强的钙结合能力(图1，蓝色曲线)，测得ZmCPK17与Ca2+的亲和力(Kd)为627.46 nM，与已知的钙依赖型蛋白激酶AtCPK3相似(图1，紫色曲线)。这表明ZmCPK17是一个典型的钙依赖型蛋白激酶，其活性可以通过钙离子直接激活。而ZmCPK2与Ca2+结合能力较弱(Kd=10194nM)，是一种钙非依赖性CPK(图1，绿色曲线)。

图1 微量热泳动技术(MST)测定ZmCPK2、ZmCPK17和AtCPK3与Ca2+的亲和力

Microscale thermophoresis assay

Microscale thermophoresis assay was performed as previously described (Ding et al., 2022). The recombinant proteins GST‐ZmCPK17, GST‐ZmCPK2, GST‐ZmCPK2‐NKJ or GST‐AtCPK3 were purified using glutathione Sepharose 4B, and the buffers were replaced by PBS with 0.005% Tween‐ 20 (PBST) using column A (NanoTemper Technologies). Next, 10 µmol/L proteins (100 µL) were labeled with excess NHS NT‐647 dye at a molar ratio of 1:5 for 30 min at room temperature in the dark. Free unlabeled dye was removed by column B, which was re‐equilibrated with PBST buffer. Different concentrations of CaCl2were added to MST buffer (50 mmol/L Tris‐HCl (pH 7.4), 10 mmol/L MgCl2, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EGTA and 0.05% Tween‐20). To obtain defined free Ca2+concentrations we added 4.9938 mmol/L for 20 µmol/L, 4.9585 mmol/L for 10 µmol/L, 4.904 mmol/L for 5 µmol/L, 4.805 mmol/L for 2.5 µmol/L, 4.63 mmol/L for 1.25 µmol/L, 4.2874 mmol/L for 625 nmol/L, 3.7523 mmol/L for 312.5 nmol/L, 3.003 mmol/L for 156.25 nmol/L, 2.1458 mmol/L for 78.125 nmol/L, 1.515 mmol/L for 39.0625 nmol/L, 0.913 mmol/L for 19.5313 nmol/L, 0.509 mmol/L for 9.7656 nmol/L CaCl2. MST buffer with different CaCl2was mixed with the same amount of labeled protein (10 µL). After gently mixing proteins and CaCl2, the mixtures were loaded into capillaries (NanoTemper Technologies) and analyzed by NanoTemper Monilith Instrument (NT.115) (NanoTemper Technologies) with 20% LED power and 20% MST power. Dissociation constant (Kd) was calculated using MO. Affinity Analysis (v2.2.4).

02►

MST技术检测蛋白与钙离子互作（小麦）

山东大学生命科学学院刘树伟教授课题组在国际学术期刊《Molecular Plant》(一区：IF17.1)发表了题为“Ca2+-dependent TaCCD1 cooperates with TaSAUR215 to enhance plasma membrane H+-ATPase activity and alkali stress tolerance by inhibiting PP2C-mediated dephosphorylation of TaHA2 in wheat”的研究论文。该论文首次解析了钙离子结合蛋白TaCCD1通过与生长素早期响应蛋白TaSAUR215互作抑制TaPP2C.D1/8的磷酸酶活性从而调控细胞质膜（PM）H+-ATPase的磷酸化水平以促进小麦耐碱性的分子机制，为小麦抗碱育种改良提供了理论依据和基因资源。

为了揭示SR4耐碱的分子机制，作者进一步研究发现钙离子信号在SR4耐碱中发挥重要作用。在碱胁迫下，TaCCD1在SR4的根中被特异性诱导，但在JN177的根中几乎不受碱胁迫的影响(图2A)，其在小麦中过量表达能够促进PM H+-ATPase活性并增强小麦对于碱胁迫的耐受性。作者利用微量热泳动技术（MST）发现TaCCD1能够结合Ca2+，并发现TaCCD1能够结合Ca2+（图2B）。而且在Ca2+存在下，TaCCD1可以与苯基琼脂糖凝胶结合；当向缓冲液中添加钙离子螯合剂（EGTA）时，TaCCD1从苯基琼脂糖凝胶柱中洗脱，表明TaCCD1与苯基琼脂糖凝胶的相互作用依赖于Ca2+结合（图2C）。为了进一步验证TaCCD1能够结合Ca2+，该研究对TaCCD1-谷胱甘肽巯基转移酶 (GST）进行实验发现，荧光强度随蛋白质浓度的增加而降低，表明上清液中的游离Ca2+可以与TaCCD1-GST结合（图2D）。然而，添加TaCCD1（D84A/D86A/D88A/E95A）突变蛋白，并没有降低上清液中的荧光强度，这表明TaCCD1-GST蛋白结合Ca2+需要这四个残基（图2D）。

图2 TaCCD1促进小麦对碱胁迫的耐受性机制研究

参考文献

[1] Hu X, Cheng J, Lu M, et al. Ca2++‐independent ZmCPK2 is inhibited by Ca2+‐dependent ZmCPK17 during drought response in maize[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2024, 66(7): 1313-1333.

链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/jipb.13675

[2] Cui M, Li Y, Li J, et al. Ca2+-dependent TaCCD1 cooperates with TaSAUR215 to enhance plasma membrane H+-ATPase activity and alkali stress tolerance by inhibiting PP2C-mediated dephosphorylation of TaHA2 in wheat[J]. Molecular Plant, 2023, 16(3): 571-587.

链接：

https://www.cell.com/molecular-plant/fulltext/S1674-2052(23)00010-2

佰莱博生物提供全方位的生物分子相互作用检测服务，涵盖生物物理、生物化学、细胞生物学以及计算机模拟等多个技术。具体服务内容如下：

(1) 生物物理实验：

ITC、SPR、MST、BLI、DSF、nanoDSF、MALS(动静态光散射)、AUC(分析型超离)、CD(圆二色光谱技术)

(2) 生物化学实验：

CETSA、Small Pull-Down、GST Pull-Down、Co-IP 、DARTS

(3) 细胞生物学实验：

小分子免疫荧光(小分子荧光共定位)

(4) 计算模拟实验：

虚拟筛选、分子对接、分子动力学模拟、基于AI的蛋白质设计

B18171330319 (南区)