Bulk WES 和单细胞DNA测序重建肿瘤突变谱系

研究背景

三阴性乳腺癌经常进展为转移性疾病，导致生存率较差，过去的研究表明其存在广泛的瘤内异质性ITH，对化疗产生耐药性。而单细胞基因组测序 scDNA-seq 是研究 ITH 的一种重要方法，过去在方法进行 WGS 可以用于拷贝数变异分析，但是对于突变分析需要较高的测序深度。因此作者认为应该进行单细胞基因组区域测序（外显子或靶向），并开发出来 MPT-scDNAseq方法。该方法结合了批量 DNA 测序、基于单细胞液滴的微流体和定制的靶向面板。

研究方法

流程：

• 1.先对5例TNBC患者的冷冻样本及其配对正常样本进行 bulk WES，测序深度是肿瘤200x，正常样本60x，然后分析得到 Somatic mutation
• 2.对得到的所有 Somatic mutation 汇集在一起，然后定制商业化的靶向测序panel
• 3.在Mission Bio 平台进行 scDNA-seq，每个肿瘤样本大约分析 5000个肿瘤细胞

• bulk-wes 测序和分析：在经过 FACS 富集分选之后，采用 Roche 的 Nimblegen 外显子捕获试剂盒进行捕获，用 Hiseq4000 进行双端测序，测序读长是 100bp。得到 fq 之后，bowtie2 比对到参考基因组 hg19，然后去重复和GATK流程，最后用 ANNOVAR注释VCF 文件。

• MPT panel 设计和测序：对外显子测序得到VAF在 0.1%~100% 的突变基因设计扩增子，最终确定 330 扩增子。然后在 Mission Bio 平台进行测序和分析。

研究结果

• TNBC 的 bulk WES：实际上是先对肿瘤细胞进行FACS富集的，保留肿瘤倍性在 2.65~3.7 的非整倍体细胞（图2A），然后进行全基因组测序估计拷贝数（图2B），外显子测序（Roche，Nimblegen v2）鉴定体细胞突变（图2C）、突变特征（图2D）以及VAF（图2E）。

• 然后设计好 MPT panel 后在 microdroplet (Mission Bio) scDNA-seq 平台对5个肿瘤的23526个细胞进行单细胞测序。对得到的结果进行降维聚类（UMAP）后，发现 TN4 肿瘤是多克隆的，其4141个单细胞主要分为 3个肿瘤亚克隆和1个二倍体细胞（正常细胞）（图3A），将突变的杂合性进行聚类和热图可视化后也可以明显看到每个亚克隆中的突变基因（图3B）。然后基于单细胞测序得到的 SNV 和 CNV 结果构建进化树以推断时间顺序，发现肿瘤亚克隆中的躯干突变（早期）包括 TP53和NOTCH3拷贝数缺失、 DMKN 和GRIN3A染色体增加，TP53、GRIN3A、PTPN4和AKAP6 点突变。c3 亚克隆最接近该样本的共同祖先（MRCA）。同样TN2 肿瘤也是多克隆的。

• 而对于TN1 TN3 TN5 肿瘤样本，则表现为单克隆

• 单细胞测序和 bulk wes 测序结果比较：两个数据集之间 VAF 的 Pearson 相关系数的计算显示 5 名患者之间存在高度相关性（平均值 = 0.876），表明它们高度一致。但是对于克隆成分，两者分析的结果并不一致。PyClone2 分析的 WES 数据经常高估了亚克隆数量。

总结

利用 MPT scDNAseq 方法可以更加精确了解肿瘤克隆结构，重建克隆谱系，对肿瘤进展中的发生突变的事件有了更加准确的认知。不过该研究也还有其他局限性，如样本仅来自单个时间点，无法准确区分突变在进化过程中是短暂性爆发还是存在选择性保留的。另一个局限的是，分析仅关注外显子突变位点设计 MPT panel 的，导致一定的偏差，如果能实现单细胞外显子或全基因组测序，得到的结果会更加准确。