人类胃癌(GC)器官特异性转移的转录异质性

文章概述

文章标题：《Revealing the transcriptional heterogeneity of organ‐specific metastasis in human gastric cancer using single‐cell RNA Sequencing》

发表日期和杂志：2022年发表在Clinical and Translational Medicine上

在线阅读链接：https://doi.org/10.1002/ctm2.730

单细胞实验设计

使用了单细胞RNA测序技术评估了来自6名患者的10个新鲜人体组织样本，共计42,968个细胞。

使用组织学检测方法对测序结果进行验证，并利用bulk RNA-seq转录组数据集进一步确认单细胞测序发现的模式和趋势。

单细胞转录组数据情况

数据链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE163558

样品详情：

来自6名患者的10个新鲜人体组织样本，包括3个原发性肿瘤样本(PT)、1个邻近非肿瘤样本(NT)和6个转移样本(M)

转移样本包括 2个肝脏转移样本(Li)、2个淋巴结转移样本(LN)、1个腹膜转移样本(P)和1个卵巢转移样本(O)

GSM5004180 primary gastric cancer PT1
GSM5004181 primary gastric cancer PT2
GSM5004182 primary gastric cancer PT3
GSM5004183 adjacent non-tumoral NT1
GSM5004184 gastric cancer lymph node metastasis LN1
GSM5004185 gastric cancer lymph node metastasis LN2
GSM5004186 gastric cancer ovary metastasis O1
GSM5004187 gastric cancer peritoneum metastasis P1
GSM5004188 gastric cancer liver metastasis Li1
GSM5004189 gastric cancer liver metastasis Li2

提供的是10X的标准三文件格式数据，直接下载我们需要的数据即可！

这篇文章的复现讲解视频已经分享在B站了，并且组建了文献复现交流群：单细胞文献复现月更交流群（门票99哦）

那这篇推文我们一起来了解一下文献中的分析方法，以及主要的结果概述！

文章单细胞分析流程

1. 数据比对和定量：
   • 使用10x Genomics公司的CellRanger套件（版本3.0.2）对原始测序数据进行比对和定量。
   • 以人类基因组GRCh38作为参考基因组，使用CellRanger计数模块来映射读取的数据。
2. 数据导入与预处理：
   • 将每个实验条件下的原始基因表达矩阵导入R软件（版本3.6.3）。
   • 使用Seurat R包（版本3.1.5）进行后续分析。
3. 质量控制：
   • 排除表达少于200个独特基因或多于5000个独特基因的细胞。
   • 排除线粒体读取比例超过20%的细胞。
4. 数据标准化：
   • 剩余的42,968个细胞的基因表达矩阵通过全局缩放方法和默认比例因子进行标准化。
   • 使用自然对数转换（log(1+x)）进行数据转换。
5. 变异基因选择：
   • 使用Seurat中的FindVariableGenes函数选择变异表达基因。
6. 数据整合与缩放：
   • 使用IntegrateData函数合并所有样本的数据。
   • 通过ScaleData函数对整合后的数据进行缩放，以消除不想要的变异来源。
7. 细胞周期评分与回归：
   • 基于Seurat在线方法，进行细胞周期评分和回归分析，以评估细胞周期异质性对数据分析的影响。
   • 每个细胞根据其G2/M和S期标记物的表达被分配一个细胞周期评分。
   • 根据细胞周期评分，将每个细胞分配到不同的阶段（G2/M、S或G1）。
8. 细胞周期效应的去除：
   • 在数据缩放时，将细胞周期评分作为变量进行回归，以去除细胞周期效应。
   • 模型的残差被缩放和居中化处理。
9. 主成分分析（PCA）与tSNE降维：
   • 选择最重要的20个主成分进行PCA。
   • 使用tSNE进行降维处理。
10. 细胞聚类：
    • 使用Seurat中的FindClusters函数进行细胞聚类。
    • 通过表达典型标记基因来注释聚类。

文章主要结果简介

第一层次降维聚类分群

单细胞数据来自6名患者的10个新鲜人体组织样本，包括3个原发性肿瘤样本(PT)、1个邻近非肿瘤样本(NT)和6个转移样本(M)

经过质量过滤，共检测到42 968个细胞，在降维和无监督细胞聚类之后，鉴定出七个细胞亚群：

• 上皮细胞(1743;EPCAM, KRT19, CLDN4)
• 基质(1288;PECAM1, CLO1A2, VWF)
• 增生细胞(1089;Mki67, stmn1, pcna)
• T细胞 (24 448;Cd3d, cd3e, cd2)
• B细胞 (7708;CD79A, IGHG1, MS4A1)
• NK细胞(NK, 1173;KLRD1, GNLY, KLRF1)
• 髓系(5519;CSF1R、CSF3R、CD68)

在不同的原发肿瘤和转移瘤中，每种细胞系的比例差异很大，揭示了一种异质性的细胞状态。

恶性上皮识别与打分

文章分析方法

• 从TCGA数据库下载了胃腺癌的RNA测序数据集
• 识别差异表达基因(DEGs) ：从TCGA数据中，分别在肿瘤组织和正常组织中选择了调整后的p值小于0.01的前50个差异表达基因(DEGs)。
• 恶性和非恶性评分：使用Seurat R包中的AddModuleScore函数，基于上述DEGs计算恶性评分和非恶性评分。
• 初步定义细胞类型：通过计算每个上皮细胞的恶性评分与非恶性评分之差，并根据得分的排名来拟合生长曲线，初步定义了假定的恶性和非恶性上皮细胞。
• 细胞类型的划分：根据生长曲线的拐点附近的最大间隔，将得分较高的细胞划分为恶性细胞(得分 > -0.02)，得分较低的细胞划分为非恶性细胞(得分 < -0.02)。

恶性与非恶性上皮细胞分析

通过特定的恶性和非恶性评分系统定义了1615个恶性上皮细胞和128个非恶性上皮细胞，其中83%的非恶性上皮细胞来源于非肿瘤样本(NT)

在原发性肿瘤(PT)和转移性肿瘤(M)中，恶性细胞通过聚类分析被分为四个亚群：G0至G3

在不同的样本和不同的转移灶中检测到恶性细胞的转录异质性

亚群特征：

• G0亚群：构成大部分原发性肿瘤和多数转移肿瘤的主体，表现出肿瘤血管生成和侵袭特性，涉及多个信号通路的显著富集，如血管生成、血管内皮细胞粘附和肌动蛋白应激纤维形成。G0细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)等与细胞侵袭和血管生成相关的基因显著上调。
• G1亚群：主要在卵巢(O)和腹膜(P)转移样本中发现，特异性表达上皮-间充质转化(EMT)相关基因，如SRGN、VIM和LAPTM5A，与肿瘤细胞的迁移和EMT特性相关。
• G2亚群：主要在淋巴结(LN2)和PT3中发现，p53信号通路激活，可能诱导细胞凋亡和抑制肿瘤生长，表现为休眠样肿瘤细胞。
• G3亚群：在PT和多数M中发现，但不在肝脏(Li)转移样本中，表现出肿瘤恶性进展特性，EMT相关基因如ZEB2、VIM和ID2显著上调，表达癌症干细胞(CSCs)标志物，具有EMT诱导的CSC表型。

IPA分析

通过Monocle 2获得的伪时间轨迹轴显示了恶性上皮细胞的动态特征和异质性

生存分析：

使用TCGA数据库中的胃腺癌队列进行生存分析，发现高表达G0、G1和G3亚群相关基因的患者整体生存率较差。

基因拷贝数变异(CNVs)分析：

使用CopyKAT工具分析了原发性肿瘤和转移灶中的基因拷贝数变异，基于基因组拷贝数轮廓识别出四个亚克隆(0-3)。

非上皮细胞的恶性评分：

97%的非上皮细胞为非恶性，而3%的非上皮细胞为恶性，这些细胞主要在髓系细胞、基质细胞和增殖细胞中发现。

肿瘤相关基因表达：

在非上皮恶性细胞中检测到肿瘤相关基因的表达，但与恶性上皮细胞相比，这些细胞很少表达上皮标志基因，表明这些细胞不是GC肿瘤细胞。

T和B细胞介导GC进展过程中免疫反应

T细胞细分

T和B细胞在所有样本中占很大比例。T淋巴细胞参与许多不同类型的免疫反应，并成为许多免疫检查点抑制剂的靶标。

对24448个T细胞进行了非监督聚类以揭示亚型

鉴定出具有独特特征基因的11个亚簇，包括5个CD8+亚簇、5个CD4+亚簇和1个未知亚簇

CD4+ T细胞亚群：

• naïve CD4+ T细胞
• 调节性T细胞(Tregs)
• 耗竭CD4 T细胞
• 效应记忆CD4+ T细胞(CD4+ TEM)
• GADD45B+ T辅助1型(Th1)样CD4+ T细胞

CD8+ T细胞亚群：

• naïve CD8+ T细胞
• 细胞毒性CD8+ T细胞
• 耗竭CD8+ T细胞
• 效应记忆CD8+ T细胞(CD8+ TEM)
• 粘膜相关恒定T(MAIT)细胞

肿瘤微环境中的T细胞亚群：

肿瘤样本(PT和M)中富集了耗竭的CD4+ T细胞和Tregs，而CD4+ TEM、CD8+ TEM和细胞毒性CD8+ T细胞的比例在M中较NT有所降低，表明肿瘤进展和转移过程中产生了抑制性的免疫微环境。

文章小结

• 文章对胃癌(GC)单细胞转录组测序分析发现恶性上皮细胞亚群的特征，以及它们与肿瘤侵袭、腹膜内转移倾向、上皮-间充质转化(EMT)诱导的肿瘤干细胞表型或休眠样特性之间的关联。
• 识别了与侵袭特性、腹膜内转移倾向、EMT诱导的肿瘤干细胞表型或休眠样特性相关的恶性上皮细胞亚群。
• 通过基因表达与患者生存率的关联，分析发现高表达与前三个亚群相关的基因在407个样本的GC队列中与整体生存率较差相关。
• 分析发现免疫和基质细胞表现出细胞异质性，创造了一个促进肿瘤生长和免疫抑制的微环境。