空间转录组学: 计数矩阵 定量

引言

本系列讲解 空间转录组学 (Spatial Transcriptomics) 相关基础知识与数据分析教程[1]，持续更新，欢迎关注，转发，文末有交流群！

从原始读段到计数矩阵

把测序产生的海量读段（reads）整理成一张计数矩阵（count matrix），通常都遵循一套标准流程。无论用哪种分析软件，大致都要经历下面四步：

1. 条形码解析（Barcode Deconvolution）
2. 读段比对（Read Alignment）
3. 过滤与质控（Filtering and QC）
4. 计数与分箱（Counting and Binning）

完成上述步骤后，还要在计数矩阵层面再做一轮质控和处理，包括：

• spot level 再次过滤和质控
• 数据归一化（Normalization）
• 特征挑选（Feature Selection）

条形码解析

虽然测序读段（reads）本身已经携带大部分信息，但要把它们变成计数矩阵，还得借助一张“坐标对照表”——用来说明 Read 1 中的 Coordinate IDs (CIDs) 对应到芯片上的哪个具体位置。

不同空间转录组平台做法不一样：像 10X Visium，每个芯片的坐标是固定死的，对照表随协议版本一起发布；而另一些平台，芯片上的坐标是随机打的，供应商会随芯片附赠一个专属对照文件。对于固定坐标的芯片，软件（如 Space Ranger）只需知道芯片编号就能自动下载对应表；若是随机坐标的芯片，就得用户自己把这份文件准备好。

把读段按 CID 还原到真实空间位置的过程就叫“条形码解析”（barcode deconvolution），它是空间转录组数据分析的头道工序。由于不同平台、不同批次在这一步差异最大，理解其细节比后面几步都关键。

reads 比对

转录本序列本身只是字符串，要想知道这些序列来自哪个基因，就必须把它们比对到带基因注释的参考基因组上。

常用的比对软件有 STAR 和 Rsubread。10X 的官方流程 SpaceRanger 和华大的 SAW 底层都调用了 STAR。

过滤与质控

在reads层面，我们要综合前面每一步的信息来做质控：

• 质量分太低的reads直接扔掉；
• 条形码对不上已知 CID 或 MID/UMI 的reads不要；
• 没比对到基因组、比对到多个地方或落进内含子区域的reads，也可能被剔除。

完成这一轮“粗筛”后，再用质控指标给数据做“精修”，可在reads层面继续筛，也可留到后面按spot再筛。常用指标和图有：

• 质量分分布图：能看出是否有污染或 RNA 降解；

• 比对统计：验证比对软件设置是否正确，映射质量如何；

• UMI 重复分布：看 PCR 是否过扩增，进而判断测序深度够不够。

计数与合并

当所有reads层面的处理都完成后，我们已用解析出的 CID 把每条reads定位到了芯片上的具体位置。接下来，就可以按“gene × spot”的格式建表，并统计每个spot里每个基因的reads数。

为了让数据不那么稀疏、分析更顺畅，绝大多数平台会再做一步“合并spot”（binning）：把相邻的 n × n 个小方格（n 常取 20、50、100 或 200，取决于原始spot有多密）里的读段数加在一起，形成更大的“宏点”。

如果平台的spot比组织里的细胞还小，我们还能把 binning 做到真正的“单细胞级”。做法是利用高倍显微图和 DAPI 核染色（如果有）先画好每个细胞的轮廓，再把落在这轮廓里的spot读段汇总成一个“细胞对象”——思路跟正方形合并类似，只是把方格换成了细胞边界。

Reference

[1]

Ref: https://lmweber.org/OSTA/