三代测序100问（20）：对于三代测序平台，有哪些靶向捕获策略？

三代测序技术以其直接读取长片段DNA或RNA的能力，在基因组从头组装和全长转录组分析等领域展现出无与伦比的优势。然而，在许多研究场景中，我们的兴趣并非遍布整个基因组，而是聚焦于特定的基因或功能区域。最近，李老师就收到了许多老师的咨询：“如果我只对特定的基因或基因组区域感兴趣，适用于三代测序平台的靶向富集方案都有哪些？” 今天，我们就来系统地梳理一下当前主流的几种策略。

在三代测序平台上，目前常见的靶向富集策略大体可以分为四种：PCR或多重PCR扩增法，靶向探针捕获法，ONT平台的自适应采样技术，以及ONT开发的基于CRISPR/Cas9的靶向测序方案。

策略一：PCR或多重PCR扩增法——经典、高效

• 原理： 这是最直接的富集方法。通过设计一对或多对特异性引物，利用PCR技术将目标区域从复杂的基因组背景中大量扩增出来。一个典型的应用便是利用通用引物对细菌的16S rRNA基因全长进行扩增，用于菌群分类研究。
• 优缺点分析： 优势： 灵敏度极高，能够从极微量的样本中富集目标；成本相对低廉；操作流程简单快捷。 劣势： 对于多重PCR，引物设计（尤其是在避免引物二聚体和保证扩增均一性方面）要求高，优化过程可能非常繁琐；容易产生扩增偏好（amplification bias），导致不同区域的覆盖度不均；最关键的是，PCR过程会完全消除DNA/RNA上天然的甲基化等表观遗传修饰信息。
• 适用场景： 更适合小规模目标区域（如少数几个基因或外显子）的富集，或微生物菌群的16S/18S/ITS等扩增子测序。

策略二：靶向探针捕获法——中到大规模Panel的理想选择

• 原理： 该方法通过设计一系列与目标DNA序列互补的、带有生物素（Biotin）标记的探针，使其与打断的基因组DNA文库进行液相杂交。随后，利用与生物素有极高亲和力的、包被在磁珠上的链霉亲和素（Streptavidin），将与探针结合的目标DNA片段精准地“钓”取出来。
• 优缺点分析： 优势： 覆盖范围广，可以轻松地同时捕获成百上千个基因，甚至整个外显子组；富集均一性通常优于多重PCR。 劣势： 实验步骤相对繁琐，杂交反应时间较长（通常需要十几个小时）；成本高于PCR法；同样，捕获后的文库构建通常需要PCR扩增，也会丢失修饰信息。
• 适用场景： 癌症基因panel检测、大规模遗传病筛查、外显子组测序等中到大规模的靶向富集项目。

策略三：自适应采样（Adaptive Sampling）——ONT平台的“智能筛选”

• 原理： 这是ONT平台独有的、一种在测序过程中完成的计算驱动型富集技术。当一条DNA分子刚刚进入纳米孔时，测序仪会实时对其头部的几十到几百个碱基进行快速比对。如果判断这条序列不属于预设的目标区域，系统会立即施加一个反向电压，将其“弹出”纳米孔；而目标片段则被允许继续通过，完成全长测序。
• 优缺点分析： 优势： 极其灵活，无需任何物理探针或引物，只需提供目标序列文件即可；完全PCR-Free，能够完整保留天然的碱基修饰信息；可以随时动态调整目标区域。 劣势： 由于频繁的分子“拒绝”操作（施加反向电压），会对纳米孔蛋白造成一定的损伤，导致测序芯片的有效数据产量（yield）显著下降（通常会降低40-60%）。
• 适用场景： 需要快速、灵活地聚焦特定测序区域的研究；尤其适合需要在靶向区域内同时分析序列和DNA修饰的研究。

策略四：基于CRISPR/Cas9的靶向测序——精准“剪切”与测序

• 原理： 这是ONT开发的一种创新的靶向富集方案。它利用Cas9酶和预先设计的导向RNA（gRNA），在目标DNA片段的两端进行精准的“剪切”（实际上是形成切口或直接切断）。随后，利用Tn5转座酶等技术，直接在这些切口处高效地连接上测序接头。这样，在测序时，只有那些成功连接了接头的靶区域片段才能被有效测序。
• 优缺点分析： 优势： 无需PCR扩增，能够完整保留甲基化等修饰信息；能够富集非常长的DNA片段（数十kb甚至更长），非常适合检测大的结构变异（SVs）；特异性高。 劣势： 实验流程相对复杂，对gRNA的设计和效率要求高；成本相对较高。
• 适用场景： 在特定长片段区域内研究复杂的结构变异或DNA修饰；对已知结构变异断点进行富集和测序验证。

总结与决策

最后，我们简单总结一下这四种策略的选择之道：

好了，这期内容就到这里。希望这份梳理能帮助您在启动三代靶向测序项目时，做出最明智的决策。我们下期再见！