**摘要：**重组人IL-7和IL-15是细胞治疗培养工艺中常用的γ链细胞因子，但将传统冻干蛋白开发为低浓度、即用型液体制剂时，需要解决蛋白聚集、容器表面吸附、氧化及长期储存过程中活性保持等问题。Akron Bio公开的Closed System Solutions（CSS）制剂开发资料，以0.01 mg/mL为目标浓度，比较了三种不同缓冲体系、去污剂及抗氧化辅料组合，并通过RP-HPLC、SDS-PAGE和细胞生物测定评价制剂稳定性。结果显示，IL-15在不同配方中的长期稳定性存在明显差异，制剂II在2–8℃储存12个月后RP-HPLC纯度约65%，而制剂III约39%；IL-7在两种制剂中的纯度变化较小，但9个月时蛋白浓度存在明显差异。本文结合具体实验条件和数据，分析低浓度液体细胞因子的制剂筛选逻辑，以及为什么蛋白浓度、纯度和生物学活性必须分别评价。

**关键词：IL-7液体制剂、IL-15液体制剂、重组人细胞因子、Akron Bio、CSS、制剂稳定性、缓冲体系、蛋白氧化、RP-HPLC、SDS-PAGE、细胞因子效价、2–8℃储存、CAR-T培养**

---

## 一、为什么低浓度液体细胞因子比冻干制剂更需要关注稳定性

在CAR-T及其他工程化免疫细胞培养中，IL-2、IL-7和IL-15等γ链（γc）细胞因子常被用于支持细胞生长和扩增。传统冻干制剂在实际使用前需要复溶，而即用型液体制剂可以减少复溶及后续分装操作，因此逐渐受到封闭式、自动化细胞制造工艺的关注。

不过，将细胞因子从冻干状态转换成液体状态，并不是简单地把冻干蛋白溶解后装入容器。对于低浓度蛋白溶液，制剂开发需要同时关注多个因素，包括蛋白在水溶液中的理化稳定性、与容器材料的相互作用、氧化相关变化，以及在整个储存周期内能否保留所需的生物学活性。

Akron Bio公开的液体制剂开发工作，选择重组人IL-7（rHuIL-7）和重组人IL-15（rHuIL-15）作为研究对象，以0.01 mg/mL，即10 μg/mL的目标浓度开展制剂筛选。这一浓度条件的研究意义在于，蛋白总量较低时，制剂中任何蛋白损失或结构变化，都可能对最终可检测浓度和有效活性产生影响。

因此，这类液体细胞因子的评价不能只回答“放置一段时间以后是否仍然有活性”，而需要进一步区分蛋白浓度是否下降、纯度是否改变，以及生物测定结果能否支持其持续具有相应功能。

## 二、制剂研究使用了哪些检测方法

研究采用与Akron Bio已有rHuIL-7和rHuIL-15冻干产品相关的生产及纯化工艺制备细胞因子，并使用符合cGMP要求的化学品配制不同液体制剂。液体样品灌装于Entegris Aramus 2D一次性袋组件中，以评价特定配方在袋装储存条件下的表现。

在分析方法上，研究同时采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）和SDS-PAGE分析蛋白理化属性。其中，RP-HPLC用于测定相关蛋白浓度及纯度，原始方法通过未氧化rHuIL-7或rHuIL-15的对应色谱峰积分计算蛋白浓度；SDS-PAGE则用于分析蛋白条带及相应纯度变化。

除了理化分析，研究还分别使用2E8细胞和CTLL-2细胞评价IL-7与IL-15的生物学活性，并采用平行线浓度—反应模型，对照NIBSC参考标准估算相对效价。相关方法遵循USP <1032>《生物测定的设计与开发》和USP <1034>《生物测定的分析》中的相应原则。

这套检测设计的价值在于，研究没有把蛋白浓度、纯度和效价视为同一个指标。即使某个样本在SDS-PAGE中仍然表现出较高的目标蛋白条带比例，也不意味着其RP-HPLC纯度或生物学效价必然完全不变。

## 三、三种IL-15液体制剂的主要区别是什么

为了分析配方对低浓度IL-15稳定性的影响，研究设计了三种液体制剂，分别改变缓冲体系、去污剂及抗氧化辅料组合。

| 组分 | 制剂I | 制剂II | 制剂III |
| :---: | :---: | :---: | :---: |
| rHuIL-15（mg） | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| 中性缓冲体系 | 有 | 无 | 有 |
| 酸性缓冲体系 | 无 | 有 | 无 |
| 去污剂1 | 有 | 无 | 无 |
| 去污剂2 | 无 | 有 | 有 |
| 抗氧化辅料 | 无 | 有 | 有 |

**表1：用于IL-15初始稳定性评价的三种制剂组成**

说明：表中rHuIL-15质量栏沿用原始配方表的mg标注；后续筛选及长期稳定性研究明确以0.01 mg/mL为配制目标浓度，二者属于不同计量口径。

从表中可以看到，制剂I采用中性缓冲体系配合去污剂1，不加入抗氧化辅料；制剂II采用酸性缓冲体系，加入去污剂2及抗氧化辅料；制剂III则使用中性缓冲体系，但与制剂II使用相同类别的去污剂2和抗氧化辅料。

这种设计能够比较不同配方组合的整体稳定性，但由于制剂I与制剂II同时改变了多个组分，因此不能只凭二者的结果判断稳定性差异完全来自某一种去污剂。相对而言，制剂II和制剂III都包含去污剂2及抗氧化辅料，缓冲体系不同，因此两者之间的长期比较对于理解该体系中的缓冲条件差异更有参考价值。

原始资料并未提供两种去污剂及抗氧化辅料的具体化学名称或浓度，因此不能进一步推断某一种具体辅料的独立作用幅度。

## 四、一个月初筛为什么排除了制剂I

三种制剂首先进行了为期1个月的初始稳定性评价。研究在配制后即刻及储存1个月时，使用RP-HPLC测定CSS袋内IL-15的浓度和纯度，并结合空白稀释液、IL-15标准品及未配制IL-15原液进行色谱比较。

初筛结果显示，三种制剂的稳定性存在明显差异。

制剂I在1个月后，袋内IL-15测定浓度从约6.0 μg/mL下降至约3.8 μg/mL，RP-HPLC纯度由约87%下降至约73%，同时色谱图出现额外峰。

制剂II在1个月时测得IL-15浓度约9.0 μg/mL，纯度约83%；制剂III在相同时间点的浓度约8.0 μg/mL，纯度约85%。

![IL-15三种液体制剂的初筛色谱及浓度纯度变化](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/35d4da3e7793731d2b82e5f0cb4984b6.jpg)

**图1：IL-15三种制剂在初始稳定性筛选中的浓度、纯度及RP-HPLC色谱比较。**

从这组结果看，制剂I不仅出现蛋白测定浓度下降，同时伴随纯度下降及额外色谱峰出现。因此，在这项研究条件下，中性缓冲体系与去污剂1、无抗氧化辅料的组合没有获得理想的短期稳定性表现。

制剂II和制剂III在初筛中表现相对较好，因而进入后续长期稳定性评价。

需要注意，这些结果评价的是三种具体配方组合，而不是证明所有酸性缓冲液都优于所有中性缓冲液。配方中的去污剂和抗氧化辅料也是影响整体结果的变量。

## 五、IL-15储存12个月后，制剂II与制剂III出现了怎样的差异

在长期稳定性研究中，IL-15按照0.01 mg/mL的目标浓度配制，采用每袋5 mL的灌装体积，装入20 mL CSS袋，并在2–8℃条件下储存12个月。

### 1. 制剂II：理化指标变化与生物学活性保持需要分别观察

制剂II在12个月储存过程中，pH保持在约6.3–6.5之间。SDS-PAGE纯度在已检测时间点维持在90%以上，主要处于约95%–97%范围，12个月时约96%；原始资料注明第9个月未进行对应SDS-PAGE测定。

但是，RP-HPLC结果并没有表现出完全相同的趋势。制剂II的RP-HPLC纯度从初期约85%逐渐下降至12个月时约65%，而测得的蛋白浓度在6.7–8.6 μg/mL范围内波动，12个月时约6.8 μg/mL。

![IL-15制剂II在12个月内的理化稳定性结果](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/6c370a17559bfaa81017ebf814667652.jpg)

**图2：IL-15制剂II在2–8℃条件下储存12个月的pH、SDS-PAGE、RP-HPLC浓度与纯度变化。**

这一结果说明，即使pH和SDS-PAGE条带表现相对稳定，RP-HPLC仍然可能检测到蛋白组分的变化。因此，不能仅凭SDS-PAGE纯度较高就认为液体细胞因子在储存过程中没有发生理化变化。

### 2. 制剂III：pH稳定，但蛋白纯度和浓度出现更明显下降

制剂III采用中性缓冲体系，同样配制为0.01 mg/mL，按照每袋5 mL灌装于20 mL CSS袋，在2–8℃条件下储存12个月。

研究发现，制剂III的pH在约7.3–7.5范围内保持稳定，但其他理化指标在储存后期出现明显变化。

SDS-PAGE纯度在前6个月约为96%–98%，12个月时下降至约76%；RP-HPLC纯度从约89%下降至约39%；蛋白浓度则从约8.3 μg/mL逐渐下降至约3.6 μg/mL。

![IL-15制剂III在12个月内的理化稳定性结果](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/477cfac4b331f6d74ff354a1b6117180.jpg)

**图3：IL-15制剂III在2–8℃条件下储存12个月的pH、SDS-PAGE、RP-HPLC浓度与纯度变化。**

这组结果表明，在所研究的IL-15液体体系中，pH维持稳定并不意味着蛋白浓度和纯度同样稳定。制剂III在长期储存中出现更明显的测定浓度及纯度下降，因此在研究所比较的配方条件下，其整体表现不如制剂II。

为了进一步比较两个配方，可以将长期研究中的主要数据整理如下。

| 评价指标 | IL-15制剂II | IL-15制剂III |
| :---: | :---: | :---: |
| 缓冲体系 | 酸性 | 中性 |
| 储存温度及时间 | 2–8℃，12个月 | 2–8℃，12个月 |
| pH范围 | 6.3–6.5 | 7.3–7.5 |
| SDS-PAGE纯度 | 主要约95%–97%；12月约96% | 前6月约96%–98%；12月约76% |
| RP-HPLC纯度 | 约85%降至65% | 约89%降至39% |
| 蛋白浓度 | 6.7–8.6 μg/mL；12月约6.8 μg/mL | 约8.3降至3.6 μg/mL |

**表2：IL-15制剂II与制剂III在12个月稳定性研究中的主要结果**

这里需要区分“相对更好”和“完全没有降解”。制剂II与制剂III相比表现更稳定，但其RP-HPLC纯度仍然从约85%下降到约65%。因此，这项研究能够支持制剂II在相应实验条件下具有较好的相对稳定性，却不能仅凭这些公开数据证明所有理化质量属性在12个月内完全不变。

## 六、IL-7使用相同两类制剂，为什么出现了不同于IL-15的变化

研究进一步将制剂II和制剂III用于rHuIL-7。IL-7同样以0.01 mg/mL的目标浓度配制，但灌装体积为每袋10 mL，仍使用20 mL CSS袋，在2–8℃条件下开展9个月稳定性研究。

对于IL-7制剂II，pH在研究期间保持约6.1，SDS-PAGE纯度约95%–96%，RP-HPLC纯度约98%–99%；9个月时测得蛋白浓度约7.4 μg/mL。

![IL-7制剂II在9个月内的理化稳定性结果](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/227ac7c289ddae50b5ce8dcda292b67f.jpg)

**图4：IL-7制剂II在2–8℃储存9个月期间的pH、SDS-PAGE及RP-HPLC分析结果。**

IL-7制剂III则在pH约7.2的条件下储存9个月，其SDS-PAGE纯度约93%–94%，RP-HPLC纯度约96%–98%，但9个月时测得的蛋白浓度下降至约3.8 μg/mL。

![IL-7制剂III在9个月内的理化稳定性结果](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/8245a11f1949df3d46aa72dbf972ae18.jpg)

**图5：IL-7制剂III在2–8℃储存9个月期间的pH、SDS-PAGE及RP-HPLC分析结果。**

这组结果与IL-15长期稳定性研究存在一个值得注意的区别：对于IL-7，制剂II和制剂III在9个月时的纯度指标都相对较高，但两者测得的蛋白浓度明显不同。

这一现象说明，蛋白纯度与蛋白浓度并不是可以互相替代的指标。即使检测到的目标蛋白在已回收蛋白组分中仍然占据较高比例，也不代表体系内测得的目标蛋白总量一定保持在相同水平。

因此，评价低浓度液体细胞因子时，如果只报告一个纯度百分比，而没有同步报告蛋白浓度，就可能无法完整反映储存期间的变化。

在这项IL-7研究中，制剂II在9个月时的测定浓度明显高于制剂III，因此在所研究条件下，同样表现出更好的浓度保持结果。

## 七、为什么蛋白浓度和纯度之外，还必须检测生物学效价

细胞因子的最终用途是提供生物学信号，因此，仅通过理化分析确认某种蛋白仍然存在，并不足以评价其能否维持相应生物学功能。

这项研究进一步使用细胞生物测定评价长期储存后的IL-7和IL-15活性。其中，IL-7使用2E8细胞，IL-15使用CTLL-2细胞，采用平行线浓度—反应模型并参照NIBSC标准进行效价分析。

研究结果显示，IL-7制剂II和制剂III在9个月时的每袋生物学活性均保持在10 MIU以上。

IL-15两种制剂则表现出不同的活性变化趋势。制剂II在12个月研究期间，每袋活性约维持在0.45–0.5 MIU；制剂III在第9个月时一度下降至约0.3 MIU，第12个月测得约0.4 MIU。

![IL-7与IL-15液体制剂的生物学效价稳定性结果](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/18801ee5300ae9b5e790d21fdfaca903.jpg)

**图6：IL-7与IL-15两种CSS液体制剂在2–8℃储存期间的生物学活性变化。**

这里尤其需要注意，原稿使用的是每袋活性单位（MIU/袋），而不是每毫升活性浓度。IL-7与IL-15的灌装体积也不同，因此不能将两者的每袋MIU数值直接当作相同口径的蛋白活性比较。

同时，制剂III在第12个月测得的活性高于第9个月结果，也不能直接解释为蛋白在储存过程中发生了活性恢复。原图存在相应测定置信区间，实际变化需要结合生物测定的变异性和完整原始数据解释。

综合理化和活性数据，制剂II在IL-15长期储存研究中表现出更平稳的结果；对于IL-7，两种制剂均保留一定生物学活性，但其蛋白浓度保持表现存在差异。

## 八、为什么RP-HPLC、SDS-PAGE和细胞效价可能给出不同变化趋势

IL-15研究中最有技术价值的一个现象，是SDS-PAGE纯度与RP-HPLC纯度并没有表现出完全一致的趋势。

以制剂II为例，12个月时SDS-PAGE纯度仍然约96%，但RP-HPLC纯度已经下降至约65%。如果只保留其中一个结果，就可能对蛋白储存状态作出过于简单的判断。

这种差异首先与检测方法所观察的分析属性不同有关。SDS-PAGE主要根据蛋白在特定电泳条件下的迁移及条带表现进行分析，而原始RP-HPLC方法明确涉及未氧化蛋白对应峰的积分，因此二者对不同形式蛋白变化的敏感性可能不完全相同。

但仅凭两种纯度结果的差异，不能进一步确定实际下降全部由氧化、聚集或袋体吸附中的哪一种因素造成。原始配方开发确实将氧化、聚集和表面吸附列为主要稳定性风险，并通过去污剂和抗氧化辅料进行处理，但公开资料并未给出每一种降解或损失途径的完整独立定量。

因此，制剂评价需要采用多种相互补充的方法，而不能用单一纯度数值替代其他分析。

这一研究还提示，低浓度液体蛋白制剂的稳定性判断至少需要同时考虑：

1. **蛋白浓度：**研究期间是否能够持续检测到足够的目标蛋白；
2. **蛋白纯度：**不同分析方法下，蛋白组分是否发生变化；
3. **体系环境：**pH等条件是否维持在相应研究范围；
4. **生物学效价：**蛋白是否仍然具有与预期用途相关的功能。

这些指标分别回答不同问题。即使某一指标保持稳定，也不能自动推断其他指标同样稳定。

## 九、9个月和12个月数据能否直接作为产品货架期

Akron Bio公开的制剂开发资料显示，在所研究的0.01 mg/mL浓度、特定CSS袋组件及2–8℃储存条件下，IL-7的理化和生物学活性研究覆盖9个月，IL-15覆盖12个月。

这一结果说明，研究团队已经获得相应观察期限内的稳定性数据，但不应直接将研究观察周期等同于所有液体IL-7或IL-15产品的正式标注货架期。

例如，IL-15制剂II虽然在12个月内保持了一定生物学活性，但RP-HPLC纯度仍然出现明显变化。因此，最终是否能够确定相应货架期，还需要结合产品质量标准、稳定性接受范围和完整验证资料判断。

同样，本研究采用特定袋体、灌装体积和目标浓度，结果不能直接推广到其他材质容器、更低蛋白浓度或者不同储存条件。

对于后续制剂开发，真正值得借鉴的是这项研究的评价思路：先在明确浓度和容器条件下筛选配方，再结合RP-HPLC、SDS-PAGE和生物测定开展长期观察，以多个质量属性共同判断配方适用性。

---

## 十、总结

低浓度重组人IL-7和IL-15的液体制剂开发，不只是将冻干蛋白转换成液态保存，而是需要重新建立缓冲体系、辅料组合及长期稳定性评价方法。

Akron Bio公开研究以0.01 mg/mL为目标浓度，对三种IL-15配方进行了初始筛选。其中，制剂I在1个月后出现明显的浓度和纯度下降；制剂II和制剂III初筛表现相对较好，因此进入长期研究。

在2–8℃储存12个月后，IL-15制剂II的RP-HPLC纯度约65%，测定浓度约6.8 μg/mL，而制剂III对应结果约39%和3.6 μg/mL。两者都存在理化属性变化，但制剂II的总体表现相对更好。

对于IL-7，9个月研究显示制剂II和制剂III的RP-HPLC纯度均保持较高水平，但测定浓度分别约7.4 μg/mL和3.8 μg/mL，说明纯度稳定并不代表蛋白浓度一定相同。

生物学效价研究进一步提供了功能相关证据：两种IL-7制剂在9个月时每袋活性均超过10 MIU，IL-15制剂II在12个月内每袋活性约维持在0.45–0.5 MIU。

因此，这项研究最重要的方法学启示，是液体细胞因子制剂不能只用一个分析指标判断稳定性，而需要将以下信息放在一起评价：

**配方组成与缓冲体系 → 初始稳定性筛选 → 长期蛋白浓度 → RP-HPLC与SDS-PAGE纯度 → 生物学效价 → 储存条件与适用范围。**

这些数据为低浓度液体IL-7和IL-15的制剂开发提供了参考，但具体产品的正式货架期和放行要求，仍需依据相应产品质量标准与完整验证资料确定。

## 参考文献

[1] Ruiz L, et al. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences. 2005;8:207-216.

[2] Gitlin G, et al. Pharmaceutical Research. 1996;13:762-769.

[3] Torosantucci R, et al. Molecular Pharmaceutics. 2013;10:2311-2322.

> 本文基于Akron Bio公开的CSS液体细胞因子制剂开发资料及相关参考文献整理，用于重组人IL-7、IL-15、液体蛋白制剂、缓冲体系筛选、RP-HPLC、SDS-PAGE及稳定性评价等方向的科研信息分享。文中0.01 mg/mL、2–8℃、IL-7储存9个月及IL-15储存12个月等条件，均对应原始资料中特定的制剂组成、灌装体积和包装系统。相关稳定性数据不应脱离具体条件推广，也不构成其他产品的正式效期或质量标准。

摘要：重组人IL-7和IL-15是细胞治疗培养工艺中常用的γ链细胞因子，但将传统冻干蛋白开发为低浓度、即用型液体制剂时，需要解决蛋白聚集、容器表面吸附、氧化及长期储存过程中活性保持等问题。Akron Bio公开的Closed System Solutions（CSS）制剂开发资料，以0.01 mg/mL为目标浓度，比较了三种不同缓冲体系、去污剂及抗氧化辅料组合，并通过RP-HPLC、SDS-PAGE和细胞生物测定评价制剂稳定性。结果显示，IL-15在不同配方中的长期稳定性存在明显差异，制剂II在2–8℃储存12个月后RP-HPLC纯度约65%，而制剂III约39%；IL-7在两种制剂中的纯度变化较小，但9个月时蛋白浓度存在明显差异。本文结合具体实验条件和数据，分析低浓度液体细胞因子的制剂筛选逻辑，以及为什么蛋白浓度、纯度和生物学活性必须分别评价。

低浓度IL-7/IL-15液体制剂怎么保持稳定？缓冲体系、RP-HPLC与9–12个月储存数据解析

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本研究评估0.01mg/mL低浓度重组人IL-7/IL-15液体制剂在2–8℃下储存稳定性。结果显示，IL-15制剂II（酸性缓冲体系）12个月RP-HPLC纯度约65%，优于制剂III（39%）；IL-7两种制剂纯度相近，但浓度差异显著。表明蛋白浓度、纯度与生物学活性需分别评价，多指标联合分析是低浓度细胞因子制剂筛选的关键。

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