精准医学 | Nat.Med | 通过脑脊液循环肿瘤DNA分析进行中枢神经系统转移的风险分层和匹配治疗

Basic Information

• 英文标题：Cerebrospinal fluid circulating tumor DNA profiling for risk stratification and matched treatment of central nervous system metastases
• 中文标题：通过脑脊液循环肿瘤DNA分析进行中枢神经系统转移的风险分层和匹配治疗
• 发表日期：27 February 2025
• 文章类型：Article
• 所属期刊：Nature Medicine
• 文章作者：Mei-Mei Zheng | Yi-Long Wu
• 文章链接：https://www.nature.com/articles/s41591-025-03538-5

Abstract

Para_01

1. 中枢神经系统 (CNS) 转移的基因组分析有可能指导治疗。
2. 在本研究中，我们纳入了 584 名患有非小细胞肺癌和 CNS 转移的患者，并对脑脊液 (CSF) 中的循环肿瘤 DNA (ctDNA) 进行了综合分析，并结合了临床病理注释。
3. CSF ctDNA 阳性检测与阴性检测相比，独立关联更短的生存期（风险比 (HR) = 1.9，95% 置信区间 (CI) = 1.56–2.39；P < 0.0001）。
4. 匹配的肿瘤-CSF 分析表征了导致较差生存率的 CSF 特有分子特征（HR = 1.64，95% CI = 1.15–2.32，P = 0.006）。
5. 一个整合了 CSF ctDNA 特征和临床因素的多指标 CSF ctDNA 预后模型被开发用于 CNS 转移的风险分层，并在一个独立队列中得到了验证。
6. 在具有治疗史的患者中，通过 CSF ctDNA 检测到驱动突变阳性的患者从与 CSF 匹配的治疗中显示出生存获益（HR = 0.78，95% CI = 0.65–0.92，P = 0.003）。
7. 通过 CSF 的纵向监测识别出 CNS 特异性的耐药机制，并提示第二次匹配的靶向治疗可改善生存（HR = 0.56，95% CI = 0.35–0.91，P = 0.018）。
8. 这些发现支持 CSF ctDNA 在 CNS 转移风险分层和指导治疗中的临床价值。

Main

Para_01

1. 中枢神经系统（CNS）转移的发生率，包括脑转移（BMs）和软脑膜转移（LMs），在非小细胞肺癌（NSCLC）中正在增加。
2. 此外，由于中枢神经系统转移具有高度异质性的临床结果，其管理仍然具有挑战性，许多患者经历了中枢神经系统的疾病进展和早期死亡。
3. 脑肿瘤取样的缺乏和危险性限制了我们对中枢神经系统转移的独特分子特征和生物标志物的理解。

Para_02

1. 液体活检已被提出以克服侵入性程序带来的挑战。
2. 脑脊液（CSF）中的循环肿瘤DNA（ctDNA）在LMs的补充诊断和中枢神经系统肿瘤的分子分析中优于血浆。
3. 然而，关于进一步临床应用的许多问题仍未得到解答：人们已经认识到血浆ctDNA反映了颅外肿瘤负担和生物学特性，这促进了超敏ctDNA检测技术的发展。
4. 然而，CNS转移中CSF ctDNA检测的决定因素仍然 largely 未知。
5. 当前关于BM和LM的风险模型应在前瞻性研究中进行验证。
6. 需要新的方法来进行CNS转移的风险分层，例如使用CSF ctDNA。
7. CSF ctDNA匹配治疗是否可行并转化为生存益处仍需深入探索。
8. 在小样本中观察到脑肿瘤组织和CSF之间的分子特征一致性；然而，定义CNS疾病所需的CSF基因组特征与临床病理特征之间的关系尚未报道。

Para_03

1. 因此，我们旨在全面分析584名伴有NSCLC和中枢神经系统转移患者的脑脊液（CSF），并结合其临床病理、影像学数据及长期随访记录，以：（1）明确脑脊液ctDNA与中枢神经系统转移肿瘤负荷之间的关系；（2）确定脑脊液ctDNA的独立预后价值，并通过建模临床和脑脊液ctDNA特征来改进患者风险分层；以及（3）分析患者从脑脊液匹配治疗策略和连续脑脊液监测中获得的益处。

Results

Patient cohort composition and CSF ctDNA detection

患者队列组成和脑脊液ctDNA检测

Para_01

1. 初始研究队列（n = 584）包括229例脑转移患者、341例莱特定义的患者、1例疑似LM的患者以及13例无中枢神经系统转移的NSCLC患者（这些患者表现出轻微的神经系统症状，怀疑为中枢神经系统转移，但在首次收集脑脊液时经过鉴别检查后被认为与肿瘤无关）。
2. 共有779份脑脊液样本和302份配对的患者肿瘤样本可用（图1和补充表2）。

Fig. 1: Study overview.

- 图片说明

◉ 研究设计的流程图。总共纳入了584名患有晚期非小细胞肺癌和中枢神经系统转移的患者作为初始队列。◉ 收集了与时间匹配的临床病理信息（n = 584）和影像学数据（n = 386），以确定影响脑脊液循环肿瘤DNA（ctDNA）脱落的因素。◉ 所有患者均进行了长期随访，并被纳入生存分析。◉ 在447名患者中，可以获取脑脊液采集后的治疗史，包括接受脑脊液ctDNA指导治疗的患者。◉ 除了初始队列外，还纳入了另一个由106名具有脑脊液样本的患者组成的队列，用于验证预后模型。◉ 除了脑脊液样本外，还收集了302对肿瘤样本，用于定义脑脊液特异性特征。◉ 已发表文献中的中枢神经系统转移基因组学数据也被纳入（n = 367）。◉ 在初始队列中，有122名患者在不同时间点至少采集了2次脑脊液样本。◉ 所有样本均进行了下一代测序（NGS）。

Para_02

1. 我们将ctDNA检测定义为至少发现一种肿瘤衍生的遗传改变（体细胞数目变异（SNVs）或拷贝数变异（CNVs））（脑脊液ctDNA检测，584例中396例；未检测到，584例中188例；表1和图2a；每例详细信息见补充表2），该定义与先前研究一致。
2. 对于在两个或多个时间点采集脑脊液样本的患者，最早测序结果被纳入初始队列。
3. 总体人群中检测率为67.8%（584例中396例），脑膜转移患者中为84.8%（341例中289例），脑转移患者中为46.2%（229例中106例）（图2b）。
4. 在脑膜转移患者中，细胞学阳性人群（离心脑脊液中存在肿瘤细胞）的检测率为90.5%（231例中209例），而细胞学阴性人群（离心脑脊液中无肿瘤细胞）的检测率为72.7%（110例中80例）。
5. 四种测序方法的总体检测灵敏度相当（补充图1a）。

Table 1 Patient characteristics of the initial cohort of CSF ctDNA (n = 584) 表1 初始脑脊液ctDNA队列的患者特征（n = 584）

Fig. 2: CSF ctDNA mirrored CNS tumor burden.

- 图片说明

◉ a，显示脑脊液ctDNA检测的临床病理和影像学相关性的热图。仅显示根据RANO-BM标准具有颅内可测量病灶的患者：脑转移瘤（BMs），左侧，n = 117；软脑膜转移（LMs），右侧，n = 125。脑中的肿瘤位置按大脑（额叶、顶叶、颞叶和枕叶）、小脑、脑干和间脑区域分类。连续变量被分为四分位数。◉ b，条形图显示所有中枢神经系统转移患者的检出率（584名患者中有396名，67.8%）、脑转移瘤患者（229名患者中有106名，46.2%）、软脑膜转移患者（341名患者中有289名，84.8%）（左上框），以及脑脊液细胞学阳性的软脑膜转移患者（231名患者中有209名，90.5%）和阴性患者（110名患者中有80名，72.7%，包括5名无脑脊液细胞学结果的患者）（右上框）。◉ c，在具有脑转移瘤和时间匹配的脑部MRI扫描的患者中，构建了按非靶病灶（42名患者中有13名，33.3%）分层的脑转移瘤检出率条形图，其中脑转移瘤数量<5个（100名患者中有43名，43%）和≥5个（17名患者中有11名，64.7%）。◉ d，在具有可测量脑转移瘤和时间匹配的脑部MRI扫描的患者中（n = 117），区分了脑脊液ctDNA阳性（n = 54）和阴性（n = 63）检测的脑肿瘤大小。中位数为698.9（范围，75.9–4525.8）与357.8（0–2748.8）mm²。Wilcoxon秩和检验（双侧）：**P = 0.005。误差棒表示范围，中间标记中位数值。◉ e，通过SLD测量的肿瘤大小与脑脊液ctDNA最大VAF相关（n = 117）。脑病灶数量（包括可测量病灶和<5 mm不可测量脑病灶）用不同符号标注。展示了VAF与肿瘤大小不一致的代表性病例。R和P值来自双侧Spearman相关系数。源数据

CSF ctDNA mirrored the tumor burden of BMs

脑脊液中的ctDNA反映了脑转移瘤的肿瘤负荷

Para_01

1. 多种因素是脑脊液ctDNA阳性的独立预测因子（n = 584；补充表3）。
2. 阳性脑脊液细胞学、LM诊断和既往治疗（两种或更多线）是主要因素。
3. 时间匹配的磁共振成像（MRI）在386名患者中可用，其中205名患者至少有一个可测量的脑部病灶，37名患者无脑转移迹象但脑脊液细胞学呈阳性，132名患者仅存在颅内非靶病变，12名患者为中枢神经系统转移阴性疾病。
4. 对具有可测量脑部病灶的患者的影像学特征进行了检查，大多数脑转移瘤定位于大脑（n = 242；图2a）。
5. 在具有LMs的患者中，细胞学仍然是检测ctDNA最强的决定因素（n = 125；比值比（OR）= 8.35，95%置信区间（CI）= 2.26–30.92，P = 0.001；补充表4），而在具有BM的患者中，脑部病灶大小是最强的决定因素（n = 117；OR = 3.23，95% CI = 1.24–8.41，P = 0.016；补充表5）。
6. 在具有BM的患者中，≥5个可评估BM与<5个BM或仅非靶病变相比，其ctDNA检出率更高（64.7%（17中的11）对比43%（100中的43）对比33.3%（42中的14）；图2c）。
7. 在ctDNA检测到的患者中，最长直径之和（SLD）显著大于未检测到ctDNA的患者（n = 54，698.9 mm²对比n = 63，357.8 mm²，P = 0.0045；图2d）。
8. 此外，尽管某些病例中高水平的ctDNA与低肿瘤大小相关，反之亦然，但SLD与ctDNA的最大变异等位基因频率（VAF）显著相关（n = 117，非参数Spearman’s R = 0.286，P = 0.0018）。
9. 一个混淆因素包括BM病灶数量（图2e）。

CSF ctDNA as an independent prognostic factor

脑脊液循环肿瘤DNA（CSF ctDNA）作为独立的预后因素

Para_01

1. 我们比较了有和没有可检测到的ctDNA的患者的总生存期（OS）（n = 584）。
2. 对于有多次脑脊液ctDNA检测的患者，纳入最早测序时的ctDNA状态。
3. 具有ctDNA改变的患者比没有ctDNA改变的患者生存期显著更短（中位OS = 11.1个月 vs 21.4个月；风险比（HR）= 1.9，95%置信区间 = 1.56–2.39，P < 0.0001；图3a）。
4. 这一观察结果可以推广到未经治疗（中位OS = 19个月 vs 30.4个月；HR = 1.6，95%置信区间 = 0.96–2.65，P = 0.07）和之前已接受治疗（中位OS = 9.4个月 vs 20.2个月；HR = 1.98，95%置信区间 = 1.57–2.51，P < 0.0001；图3b）的情况，以及LM（中位OS = 10个月 vs 17.4个月；HR = 1.87，95%置信区间 = 1.31–2.66，P = 0.0005）和BM（中位OS = 13.8个月 vs 25.8个月；HR = 1.71，95%置信区间 = 1.25–2.35，P = 0.0008；图3c）人群分别适用。
5. 我们开发了一个多变量模型，包括在单变量分析中与生存显著且潜在相关的临床病理因素，并发现ctDNA检测独立预测较差的生存（HR = 1.87，95%置信区间 = 1.48–2.38，P < 0.001）。
6. 较差的表现状态（PS）、阳性脑脊液细胞学、更大的转移负担和疾病进展也与较差的生存相关（图3d）。
7. 上述生存分析针对四种测序方法中的每一种进行了重复，结果支持脑脊液ctDNA作为独立预后因素的实用性（补充图1b–e）。

Fig. 3: CSF ctDNA and private genomic features as prognostic factors for CNS metastases.

- 图片说明

◉ Kaplan-Meier分析显示了在初始队列（n = 584）中，CSF ctDNA对总生存期（OS）的预后价值，其中CSF ctDNA阳性患者（n = 396），CSF ctDNA阴性患者（n = 188）。◉ P值来自未经多重假设校正的双侧Cox比例风险模型（P = 1.3 × 10−9）。◉ 在先前未治疗（系统性抗肿瘤治疗）和先前已治疗的患者中，CSF ctDNA对总生存期（OS）的预后价值分别为：先前未治疗且CSF ctDNA阳性（n = 69），先前未治疗且CSF ctDNA阴性（n = 44），先前已治疗且CSF ctDNA阳性（n = 327），以及先前已治疗且CSF ctDNA阴性（n = 144）。◉ 在患有脑转移（BMs）和软脑膜转移（LMs）的患者中，CSF ctDNA对总生存期（OS）的预后价值为：脑转移且CSF ctDNA阳性（n = 106），脑转移且CSF ctDNA阴性（n = 123），软脑膜转移且CSF ctDNA阳性（n = 289），或软脑膜转移且CSF ctDNA阴性（n = 52）。◉ 一名CSF ctDNA阳性或疑似软脑膜转移的患者以及13名无中枢神经系统转移的患者被排除在外。◉ 多变量Cox比例风险模型展示了CSF ctDNA阳性作为总生存期（OS）独立预后因素的作用（n = 584）。◉ P值经过调整且为双侧。中心点和误差棒分别代表风险比（HR）和95%置信区间（CI）。◉ CSF特异性突变富集的通路包括受体酪氨酸激酶下游通路、细胞周期和TGFβ通路。◉ 对检测频率最高的前20个基因的突变频率进行了比较，这些基因来自具有CSF特异性基因组检测（n = 134；至少通过CSF ctDNA检测到一个遗传改变但未在配对肿瘤中发现）的患者和不具有此类检测的患者（n = 62）。◉ P < 0.1被认为具有统计学意义。◉ 具有（n = 134）和不具有（n = 62）CSF特异性检测的患者的总生存期（OS）生存曲线。◉ 多变量Cox比例风险模型展示了特定基因对CSF特异性检测的预后贡献（n = 196）。◉ 检测率最高且在CSF特异性队列中富集的特定基因变异被纳入此分析。◉ P值经过调整且为双侧。中心点和误差棒分别代表风险比（HR）和95%置信区间（CI）。

CSF ctDNA in the risk stratification of LMs and BMs

脑脊液循环肿瘤DNA在LMs和BMs风险分层中的应用

Para_01

1. 我们试图确定脑脊液ctDNA在LMs和BMs风险分层中的作用。
2. 在可评估EANO-ESMO LM亚型的LM患者中（n = 310），I型组的脑脊液ctDNA检出率显著高于II型组（230例中的208例，90.4% 对比 80例中的59例，73.8%；P = 0.0002）。
3. EANO-ESMO LM亚型无法预测患者的生存期（中位OS：I型组（n = 230）对比II型组（n = 80），12.3个月对比11.4个月；HR = 0.84，95% CI = 0.63–1.11，P = 0.2）。
4. 然而，脑脊液ctDNA的检测（n = 267）与未检测到ctDNA的患者相比，总生存期更差（n = 43，中位OS = 10个月对比18.1个月，HR = 1.95，95% CI = 1.32–2.88，P = 0.0006）。
5. 在新诊断为BM的患者中（n = 61），每个molGPA组的脑脊液ctDNA检出率有所不同。
6. Kaplan-Meier生存曲线显示molGPA分级组之间无差异（GPA 0–1组（n = 6）对比GPA 1.5–2组（n = 23）对比GPA 2.5–3组（n = 25）对比GPA 3.5–4组（n = 7），中位OS = 17.3个月对比25.4个月对比24.4个月对比23.2个月，P = 0.2）。
7. 然而，可检测到的脑脊液ctDNA是新诊断为BM的患者的显著预后因素（中位OS：脑脊液ctDNA+组（n = 33）对比脑脊液ctDNA−组（n = 28），17.5个月对比41.2个月，HR = 2.11，95% CI = 1.07–4.18，P = 0.03）。

CSF ctDNA identified patients at high risk of developing LMs

脑脊液循环肿瘤DNA（CSF ctDNA）识别出高风险发展为脑转移（LMs）的患者

Para_01

1. 我们试图探讨液体活检结合脑脊液细胞学和循环肿瘤DNA (ctDNA) 状态的临床意义。
2. 在脑脊液细胞学检测呈阳性的患者中，脑脊液ctDNA阴性者的总生存期（OS）显著长于脑脊液ctDNA阳性者（中位OS = 19.4个月 vs 10.8个月，风险比HR = 2.67，95%置信区间 = 1.45–4.93，P = 0.001）。
3. 对于仅通过脑部MRI和脑脊液细胞学检测确认为脑转移（BMs）的患者，我们发现在长期随访后有34例患者发展为脑膜转移（LMs）。
4. 其中，在脑脊液ctDNA阳性患者中，48.5%（33例中的16例）在两年随访后发展为脑膜转移，这一比例显著高于脑脊液ctDNA阴性患者的23.5%（51例中的12例，P = 0.03）。
5. 在脑脊液ctDNA阳性的患者中，从检测ctDNA到确诊脑膜转移的中位提前时间为202天，显著短于脑脊液ctDNA阴性患者的417天（P = 0.01）。

CSF ctDNA depicted private genomics with prognostic value

脑脊液（CSF）中的循环肿瘤DNA（ctDNA）描绘了具有预后价值的私有基因组特征

Para_01

1. 在302名患者中获得了配对的肿瘤样本（图1和补充表2）。
2. 脑脊液ctDNA识别出具有临床可操作性的基因：其中396例中有88.1%（349例）存在驱动基因变异，包括EGFR（396例中的304例（76.8%）），ALK（396例中的27例（6.8%）），ERBB2（396例中的11例（2.8%））和ROS1（584例中的5例（1.3%））等（补充图2）。
3. 此外，脑脊液ctDNA以高一致性检测到非小细胞肺癌脑转移瘤的特异性基因组特征在亚洲人群中表现显著（脑脊液与脑组织对比，n = 396（排除阴性检测结果）对比61例，斯皮尔曼相关系数R = 0.687，P = 0.003；扩展数据图4a和补充图3a,b）。
4. 然而，使用脑脊液ctDNA检测到的特定基因突变频率与治疗前的配对原发肿瘤之间无显著相关性（33对肿瘤-脑脊液样本，斯皮尔曼相关系数R = 0.266，P = 0.171；肿瘤和脑脊液采样时间间隔≤30天；扩展数据图4b）。
5. 将所有配对肿瘤纳入分析后，无论活检器官或治疗史如何，脑脊液ctDNA与肿瘤之间的相关性增加（196对肿瘤-脑脊液样本，斯皮尔曼相关系数R = 0.519，P = 0.013；补充图4），这表明脑脊液特异性的基因组学可能受到临床因素和肿瘤内在特征的共同影响。

Para_02

1. 在纳入302对肿瘤和脑脊液样本后，我们发现肿瘤的肿瘤比例（以每个样本的最高VAF表示）高于脑脊液样本（0.34对0.1，P<0.001；补充图5a,b）。
2. 然而，在仅纳入检测呈阳性的样本后，肿瘤与脑脊液样本之间的肿瘤比例没有统计学差异（n=196，0.37对0.42，P=0.2；补充图5c）。

Para_03

1. 我们纳入了配对的脑脊液(CSF)和肿瘤组织测序数据(n = 196，排除检测阴性的病例)，以进一步明确在脑脊液中检测到的特异性改变。
2. 我们发现134名患者(68.3%，134/196；脑脊液特异性队列)在脑脊液中检测到特异性突变或拷贝数变异(CNVs)，而在肿瘤测序中未检测到这些改变。
3. 脑脊液与组织之间的差异受脑脊液和肿瘤测序之间的时间间隔、组织活检部位(样本水平)、临床病理因素(临床水平)以及肿瘤内在生物学特性的影响。
4. 在脑脊液特异性检测的患者中(n = 134)，脑脊液中的肿瘤比例显著高于肿瘤组织中的比例(0.61 vs 0.37；P < 0.001)，而在没有脑脊液特异性检测的患者中则观察到相反的结果。
5. 排名前20的脑脊液特异性改变包括在脑脊液特异性患者队列中显著富集的10个改变(MYC、CDKN2A、STK11、NTRK1、TP53、SMAD4、RB1、CDK6、CDK4和MET)，这些主要存在于RTK/RAS、PI3K、细胞周期和转化生长因子β(TGFβ)通路中。
6. 将配对的原发肿瘤与脑膜转移(LMs)和脑转移(BMs)进行比较时，显示出与LMs潜在相关的改变具有中等相关性；然而，基于治疗的脑脊液进化分析表明，NTRK1、MYC和CDKN2A可能更指示一种治疗诱导的遗传改变事件。

Para_04

1. 脑脊液特有检测显示出较差的预后（中位总生存期为9.9个月对比15.3个月，风险比=1.64，95%置信区间=1.15–2.32，P=0.006；图3f）。
2. 我们将脑脊液特有检测和特定的基因改变（具有最高检出率并在脑脊液特有队列中富集）纳入多变量生存分析模型。
3. 结果显示，脑脊液特有检测在预测预后方面具有边缘意义（图3g），这表明私有基因组变化是导致生存结果较差的主要因素。

CSF ctDNA-focused prognostic model

以脑脊液循环肿瘤DNA（ctDNA）为重点的预后模型

Para_01

1. 如前所述，可以利用多种已知的临床特征、脑脊液ctDNA检测以及脑脊液特有队列中的富集基因组学来预测NSCLC脑转移患者的生存结果（图3a、d、g）。
2. 这些特征被共同建模，以确定专注于ctDNA的预后模型的最佳特征，并测试了该模型的临床可行性。

Para_02

1. 患者被随机分为训练组（n = 292）和测试组（n = 292），比例为1:1（图4a和补充表6）。
2. 在训练集中进行了单变量Cox回归分析，以选择随后纳入多变量Cox回归的特征。
3. 最终，所选特征被缩减为五个独立指标：RB1改变、脑脊液ctDNA状态、东部肿瘤协作组体能状态（ECOG PS）、转移负担和全身进展（P < 0.1；图4b,c）。
4. 这些因素被用于构建模型，将患者分为高风险或低风险组。
5. 使用包含这五个因素的多指标模型获得了最佳模型性能（补充图7）。

Fig. 4: Five-factor, multimetric CSF ctDNA prognostic model.

- 图片说明

◉ 用于模型建立的队列（n = 292）、测试（n = 292）和验证（n = 106）。◉ 森林图显示了训练集中患者（n = 292）的总生存期（OS）风险比，该风险比是通过单变量Cox比例风险模型估计的，涉及临床和ctDNA特征。◉ P值未调整且为双侧检验。中心点和误差棒分别代表风险比（HR）和95%置信区间（CI）。◉ 多变量Cox比例风险模型包括在单变量生存分析中与总生存期显著相关的特征（训练集，n = 292，P < 0.1）。最终，五个因素（ECOG PS、转移负担、系统性进展、CSF ctDNA检测和RB1改变）仍显著与总生存期相关，并被纳入多指标ctDNA预后模型（P < 0.05）。P值已调整且为双侧检验。◉ 训练集中高风险（n = 146）和低风险（n = 146）患者的总生存期的Kaplan-Meier分析，评分基于五因素多指标CSF ctDNA预后模型。P值来自未经多重假设校正的双侧Cox比例风险模型（P = 1.3 × 10−10）。◉ 测试集中高风险（n = 157）和低风险（n = 135）患者的总生存期的Kaplan-Meier分析。◉ 验证队列中高风险（n = 29）和低风险（n = 77）患者的总生存期的Kaplan-Meier分析。原始数据

Para_03

1. Kaplan-Meier 分析显示了该模型的预后价值：低风险患者的总生存期（OS）比高风险患者更长（风险比 HR = 2.48，95% 置信区间 CI = 1.88–3.28，P < 0.0001）。
2. 这些结果在测试集中同样被观察到（HR = 2.77，95% CI = 2.08–3.68，P < 0.0001）。
3. 这一包含五个因素、多指标的脑脊液 ctDNA 预后模型在另一组患者队列中得到了进一步验证（n = 106），这些患者来自我们机构的一个子集，其脑脊液 ctDNA 使用另一种液体活检方法进行了评估。
4. 随后，我们发现该模型能够在验证队列中区分高风险和低风险患者（HR = 2.27，95% CI = 1.32–3.9，P = 0.002）。
5. 这些研究结果支持了我们分子预后模型在非小细胞肺癌中枢神经系统转移风险分层中的潜在临床应用价值。

CSF ctDNA-guided treatments

脑脊液循环肿瘤DNA引导的治疗

Para_01

1. 对于患有 NSCLC 和 CNS 转移的患者，尤其是那些在先前治疗后出现进展且缺乏标准治疗方案的患者，建立了一套常规流程来检测脑脊液（CSF）中的循环肿瘤 DNA (ctDNA)，以识别潜在的匹配治疗靶点。
2. 对于接受酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的患者，这类患者占我们总患者的 75% 以上，通过 CSF ctDNA 检测发现 CNS 转移的激活通路，包括可用药的驱动基因变异，如 EGFR 突变、ALK 融合等，以及对先前 TKI 的已知耐药机制，从而实现匹配治疗。
3. 我们还有一些未接受过 TKI 治疗的患者，通过 CSF ctDNA 检测识别出分子靶点，从而进行匹配的靶向治疗（补充表 7）。
4. 匹配的靶向治疗分为三种情况：标准治疗、超适应症使用和临床试验策略，其详细信息已在方法部分提供（补充表 7）。
5. 在本文中，我们提供了关于 CSF ctDNA 匹配策略在真实世界框架下的回顾性分析。

Para_02

1. 总体而言，536 名患者携带可用药的基因改变。
2. 其中，329 名患者接受了靶向治疗，这些治疗是基于在脑脊液 (CSF) 循环肿瘤 DNA (ctDNA) 中（n = 207）或仅组织分析中（n = 122）识别出的分子靶点定义的，另有 77 名患者接受了其他全身治疗。
3. 对于伴有脑转移或体能状态 (PS) 评分为 0–1 的患者，与 CSF ctDNA 匹配的靶向治疗机会较低。
4. 值得注意的是，CSF ctDNA 至少存在一种驱动基因改变的患者从靶向治疗中获得的总生存期 (OS) 改善程度高于其他全身治疗（中位 OS = 15 个月 vs 8.6 个月，风险比 (HR) = 1.29，95% 置信区间 (CI) = 1.09–1.53，P = 0.003）。
5. 对于 CSF 中 ctDNA 或驱动基因改变为阴性的患者，靶向治疗（仅组织匹配）与其他治疗之间的 OS 差异较小（中位 OS = 34.9 个月 (95% CI = 22.7–47.1) vs 16.8 个月 (95% CI = 8.4–25.2)，HR = 1.19，95% CI = 1–1.66，P = 0.05）。
6. CSF 和仅组织匹配组中涉及的基因包括之前已知的 EGFR、ALK、ROS1、ERBB2 和 MET 第 14 外显子跳跃突变。
7. 根据基因靶点的不同，OS 存在差异：存在 ctDNA 的 EGFR 突变患者显示出更短的生存期。
8. 我们对初治患者进行了上述分析，发现按 CSF ctDNA 是否存在分层时，靶向治疗对 OS 的影响与总体人群相似：检测到 CSF ctDNA 的患者从靶向治疗中获得的生存获益大于其他治疗（中位 OS = 20.2 个月 vs 9.3 个月，HR = 2.48，95% CI = 1.28-4.8，P = 0.007），而未检测到 ctDNA 或驱动基因改变的患者则没有（中位 OS = 未达到 vs 30.4 个月，HR = 1.06，95% CI = 0.5–2.26，P = 0.9）。

Fig. 5: CSF ctDNA-guided treatment and longitudinal genomic analysis.

- 图片说明

◉ a，接受匹配靶向治疗或非靶向治疗的致癌驱动型 CNS 转移患者的 OS 生存曲线，按脑脊液 ctDNA 检测分层：组织匹配靶向治疗（n = 122），脑脊液 ctDNA/非靶向治疗（n = 29），脑脊液 ctDNA+ 和脑脊液匹配靶向治疗（n = 207），脑脊液 ctDNA+ 和非靶向治疗（n = 48）。生存曲线采用 Kaplan-Meier 方法绘制，Cox 比例风险模型用于计算风险比和置信区间，P 值未调整且为双侧。◉ b，接受免疫检查点抑制剂（ICI）或其他系统治疗的致癌阴性 CNS 转移患者的 OS 生存曲线，按脑脊液 ctDNA 检测分层：脑脊液 ctDNA− 和 ICI（n = 9），脑脊液 ctDNA− 和其他（n = 8），脑脊液 ctDNA+ 和 ICI（n = 13），脑脊液 ctDNA+ 和其他（n = 11）。◉ c，在所有接受 TKI 治疗的致癌驱动型患者（294 名中的 79 名）以及配对肿瘤和脑脊液样本中仅检测到脑脊液耐药机制的比例（n = 10，共 22 名患者）。◉ d，接受第二次脑脊液指导靶向治疗（n = 33）以克服脑脊液检测到的耐药机制或非匹配系统治疗（n = 46）的患者的 OS 生存曲线。◉ e，一名增强绿色荧光蛋白（EGFR）突变肺癌患者从诊断到死亡的肿瘤和脑脊液 ctDNA 的纵向基因组分析。左侧下部，肿瘤和脑脊液样本标记为 P（原发或区域淋巴结）和 M（转移）。数字：1，在诊断时采集；2 和 3，在术后进展时采集；4 和 5，在厄洛替尼（Erl）和奥希替尼（Osi）治疗进展时分别采集。上部，热图显示一个原发肿瘤（P1.1）、一个区域淋巴结（P1.2）、四个转移瘤（M2、M3、M4 和 M5）和三个连续脑脊液样本的体细胞突变。中部，进化树展示了疾病在亚克隆突变簇水平上的演变过程，这些亚克隆簇通过 PyClone 推断得出。右侧，图示表示通过 DNA 面板测序分析的原发肿瘤和转移部位。插图 e 使用 BioRender.com 创建。源数据

Para_03

1. 一些患者并未携带任何可用药的基因改变（n = 41），因此接受了以免疫检查点抑制剂（ICI）为基础的标准治疗。
2. 我们探讨了使用脑脊液（CSF）中的循环肿瘤DNA（ctDNA）状态来识别从ICI治疗中获得更好预后的患者。
3. 在可检测到CSF ctDNA的患者中，与接受其他系统治疗的患者相比，ICI治疗显示出生存获益（中位总生存期OS为17.4个月对比3.9个月，风险比HR = 3.04，95%置信区间CI = 1.12–8.23，P = 0.02；图5b）。
4. 在无法检测到CSF ctDNA的患者中，与接受其他治疗的患者相比，ICI治疗并未显示出总生存期OS的改善（中位OS为25.2个月对比21.4个月，风险比HR = 0.72，95% CI = 0.21–2.53，P = 0.6；图5b）。

Overcoming resistant mechanisms detected by CSF

克服脑脊液检测到的耐药机制

Para_01

1. 随后，我们选择了在中枢神经系统（CNS）进展时脑脊液（CSF）中检测到抗性机制的患者，这些患者的抗性机制具有已知或高潜力的二次靶向治疗指征。
2. 总体而言，26.9%（79名中的294名）驱动基因阳性的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗患者表现出在靶（EGFR T790M、C797S、G724S、V769L、V774M和ALK G1202del、L1196M突变）和离靶（MET和ERBB2扩增；RET和NRTK1融合；ERBB2和BRAF G469A/G464A突变）的抗性机制。
3. 在进行时间匹配肿瘤测序的患者中（79名中的22名，肿瘤-脑脊液采集时间间隔≤60天），45.5%（22名中的10名）仅在脑脊液中检测到抗性，而未在肿瘤中检测到（图5c），这表明脑脊液循环肿瘤DNA（ctDNA）在肿瘤取样中的互补作用。

Para_02

1. 随后，在79名患者中，有24名接受了针对靶向耐药机制的第二次靶向治疗，其中9名患者的耐药机制是通过脑脊液（CSF）检测到的非靶点机制。
2. 与未接受匹配靶向治疗以克服耐药机制的患者相比，这些患者获得了生存获益（n = 46；中位总生存期OS = 14.3个月 vs 6个月，风险比HR = 1.78，95%置信区间CI = 1.10–2.89，P = 0.018；图5d）。
3. 多变量分析显示，与脑脊液检测结果匹配的靶向治疗、脑转移诊断以及体力状态PS评分为0-1是更好的生存的独立预测指标。

Longitudinal spatial–temporal genomic profiling

纵向空间-时间基因组特征分析

Para_01

1. 共有122名患者接受了≥2次脑脊液ctDNA检测。
2. 我们选择了十名具有两个或更多配对测序肿瘤和脑脊液样本（且检测结果为阳性）的患者作为代表，以说明在系统治疗后使用纵向脑脊液ctDNA监测中枢神经系统疾病的价值（补充图9）。
3. 我们详细报告了一例特定的非小细胞肺癌临床病例，该病例在4年的疾病进展过程中进行了肿瘤和脑脊液ctDNA的基因组分析：从最初可手术切除的病变诊断开始，到颈部淋巴结转移的首次进展，随后发展为脑部和软脑膜转移，在此期间，患者先后接受了厄洛替尼、奥希替尼以及奥希替尼联合阿法替尼的治疗（图5e）。
4. 六个肿瘤标本（一个肺部、一个脑部、一个纵隔淋巴结和三个转移性淋巴结）和三个脑脊液标本被纵向分析。

Para_02

1. 驱动突变，EGFR 19号外显子缺失，在原发肿瘤、远处转移和纵向脑脊液活检中均有出现。
2. 肿瘤测序分析显示，所有亚克隆突变在诊断时即已存在，包括在切除后消失并在脑部（簇4）和腹股沟淋巴结（簇2）进展期间重新出现的转移性亚克隆（图5e）。
3. EGFR T790M 突变作为对厄洛替尼产生耐药性的机制出现在脑转移进展时。
4. 纵向脑脊液采样显示，在奥希替尼治疗期间的第二次中枢神经系统进展时，未检测到脑特异性亚克隆（簇4），并且出现了新的耐药改变：EGFR T790M 和 C797S 突变。
5. 这些脑脊液结果与第二次靶向治疗方案——奥希替尼联合阿法替尼相吻合（图5e）。

Discussion

Para_01

1. 我们的结果表明，脑脊液（CSF）中的循环肿瘤DNA（ctDNA）反映了颅内疾病负担，并独立地对中枢神经系统（CNS）转移的患者进行了风险分层。
2. 此外，我们对脑脊液特有基因组的深入分析揭示了在中枢神经系统转移中富集的基因和通路及其预后价值。
3. 临床特征、脑脊液ctDNA检测和特有基因组的整合提供了更精细的生存结局风险分层，这一结论已得到验证。
4. 此外，接受与脑脊液匹配治疗的患者比未接受此类治疗的患者显示出更长的总生存期（OS）。
5. 此外，在脑脊液中检测到的耐药机制有助于实施第二次靶向治疗，这表明在临床实践中，脑脊液ctDNA检测作为中枢神经系统转移进展时组织取样的替代方法的重要性。

Para_02

1. 在患有原发性或转移性中枢神经系统恶性肿瘤的患者中，血浆 ctDNA 检测率约为 10-45%。
2. 相比之下，围绕大脑实质在脑室内和蛛网膜下腔循环的脑脊液作为中枢神经系统肿瘤的液体活检具有更优越的表现。
3. 本研究全面评估了脑脊液 ctDNA 在 CNS 转移最大且注释良好的患者队列中的临床应用价值。
4. 总体而言，本研究中 76% 的患者群体存在致癌基因改变，并接受了至少一种酪氨酸激酶抑制剂治疗，这与亚洲晚期非小细胞肺癌患者超过 70% 携带驱动基因以及多达 50% 的患者在治疗后发展为脑转移的报道一致。
5. 我们的患者代表了那些具有高风险和高 CNS 转移发生率的人群。

Para_03

1. 我们对脑脊液ctDNA检测的决定因素进行了分析，并发现临床因素增加了ctDNA释放到脑脊液中的几率，其中一些与胶质瘤的情况一致。
2. 考虑到脑转移瘤（BMs）并排除脑膜转移（LMs），我们发现了脑肿瘤大小与脑脊液ctDNA最大变异等位基因频率（VAF）之间的显著相关性，这是对晚期非小细胞肺癌（NSCLC）中血浆ctDNA结果的补充。
3. 然而，由于肿瘤数量、生物因素或脑脊液循环也可能影响结果，相关性值较低。
4. 在颅外肿瘤中，血浆ctDNA水平也与通过氟脱氧葡萄糖（FDG）正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）测量的代谢肿瘤体积相关。
5. 在本研究中，我们使用了对比增强磁共振成像（MRI），其对中枢神经系统转移瘤的评估具有更高的敏感性。
6. 因此，我们无法检查代谢活性与脑脊液ctDNA存在之间的关系。
7. 尽管如此，我们的研究报道了脑脊液ctDNA在反映中枢神经系统转移瘤负荷方面的价值，表明其作为预后生物标志物的潜力。

Para_04

1. 之前关于胶质瘤和新诊断的非小细胞肺癌脑转移的小样本研究报道指出，脑脊液ctDNA检测与更差的生存率相关，且独立于其他临床病理因素。
2. 本研究中的大数据集显示了相同的结果。
3. 更重要的是，考虑到包括临床因素和特异性基因组学在内的多种特征也与生存结果相关，我们开发了一个多指标脑脊液ctDNA模型，以更好地对中枢神经系统转移进行风险分层。
4. 值得注意的是，我们的模型通过不同的二代测序（NGS）方法得到了验证。
5. 然而，仍需进行前瞻性验证。

Para_05

1. 排除特定中枢神经系统转移患者参与临床试验的一个重要原因，是担心由于患者历史预后较差而掩盖新药的疗效。
2. 然而，中枢神经系统转移患者的生存期表现出显著的异质性。
3. 值得注意的是，在我们的研究中，脑膜转移的诊断并不是一个独立的预后因素。
4. 脑脊液细胞学阳性但循环肿瘤DNA（ctDNA）检测阴性的患者比历史报道中的患者生存期更长。
5. 因此，从以患者为中心的角度来看，当前的纳入标准代表性不足。
6. 此外，我们初步证明了脑脊液ctDNA阳性可能识别出高风险发展为脑膜转移的患者以及与中枢神经系统转移相关的更差生存结果的患者，尽管样本量有限。
7. 基于这些数据，未来针对中枢神经系统转移（特别是脑膜转移）的临床试验应进行优化。
8. 一方面，我们应该通过使用如脑脊液ctDNA等生物标志物，选择性地纳入更多具有中枢神经系统转移（尤其是脑膜转移）的患者；另一方面，我们提出了一个有趣的观点，即传统的脑膜转移定义可能受到挑战，因为脑脊液ctDNA可能更能代表中枢神经系统转移的侵袭性。
9. 对这些高风险患者进行干预治疗是一个有前景的方向。
10. 因此，脑脊液采集用于细胞学和ctDNA检测应纳入临床常规以及涉及中枢神经系统转移的临床试验，无论是否伴有神经系统症状。

Para_06

1. 少数研究使用脑脊液（CSF）进行反应评估、微小残留病监测以及接受全身治疗患者的预测生物标志物探索。
2. 我们发现，在携带可靶向改变且脑脊液循环肿瘤DNA（ctDNA）阳性的患者中，与组织导向的靶向治疗相比，脑脊液匹配的靶向治疗带来了更大的总生存期（OS）获益。
3. 另一方面，无论是否接受匹配的靶向治疗，脑脊液ctDNA阴性的患者通常比脑脊液ctDNA阳性的患者预后更好。
4. 这些结果表明了脑脊液ctDNA状态的预后价值。
5. 进一步分析显示，四分之一的患者在酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗期间出现了已知的耐药机制，进一步阐明了脑脊液ctDNA在指导治疗中的临床价值。

Para_07

1. 肿瘤样本中BM的分子特征和CSF中LM的分子特征之前已被证实。
2. 在本研究中，我们证明了BM与CSF ctDNA之间的一致性。
3. 我们展示了CSF与原发肿瘤的差异，这与之前的肿瘤测序报告一致。
4. 在一个纵向时空基因组分析案例中，我们发现CSF ctDNA可以替代肿瘤活检，用于监测脑转移的演变并检测与CNS进展相关的遗传改变。
5. 特别是，一些可用药的耐药机制，例如脑特异性克隆，可以在CSF中被识别为与CNS特定治疗最相关的生物标志物。

Para_08

1. 我们研究的主要局限性在于纳入了一组患有非小细胞肺癌和中枢神经系统转移的患者，这些患者大多有症状，并且需要进行腰椎穿刺以怀疑 LM 诊断。
2. 然而，我们采用了使用下一代测序（NGS）检测的脑脊液分子分析，生成了最大规模的脑脊液循环肿瘤 DNA 数据库，该数据库与匹配的肿瘤和全面的临床数据相关联。
3. 另一个局限性是我们使用了四种临床 NGS 检测方法，并仅包括所有检测方法覆盖的已知癌症相关基因。
4. 尽管如此，我们在四种检测方法之间重复了我们的分析，证明了它们的可重复性。
5. 这是对这些脑脊液循环肿瘤 DNA 检测方法进行临床验证的重要努力。
6. 第三个局限性在于我们没有进行匹配的血浆循环肿瘤 DNA 分析。
7. 对配对的脑脊液、血浆和肿瘤进行深入测序对于进一步阐明系统循环和脑脊液循环肿瘤 DNA 之间的关系至关重要。
8. 第四，本研究中大多数患者的脊柱磁共振成像（MRI）不可用，因此可能忽略了部分脑脊液细胞学检查阴性的患者中的 LM 诊断。
9. 尽管如此，我们认为脑脊液循环肿瘤 DNA 可能比传统诊断方法更能反映肿瘤的侵袭性，并可以作为临床使用的最佳补充生物标志物。
10. 最后，这一数据集更具有亚洲肺癌人群的代表性。
11. 考虑到全球人群的生物学多样性，未来需要涵盖更广泛地区的研究来更好地推广我们的结果。
12. 需要加强国际间的合作。

Para_09

1. 总之，我们证明了脑脊液ctDNA在反映中枢神经系统转移负担方面的临床价值，并且作为独立的预后生物标志物也具有重要意义。
2. 结合临床特征和脑脊液ctDNA指标可以提高对患者风险的分层评估。
3. 此外，患者通过纵向采样从与脑脊液匹配的治疗和疾病监测中获益。
4. 因此，我们强调有必要将脑脊液ctDNA检测纳入临床实践和未来的临床试验中。

Methods

Patient population

患者群体

Para_01

1. 我们利用2017年和2018年发表的脑脊液液体活检数据，识别了脑膜转移（LMs）的独特基因特征，这形成了关于脑脊液循环肿瘤DNA (ctDNA) 临床价值的专家共识。
2. 随后，脑脊液液体活检被纳入我们在广东省肺癌研究所的临床实践，建立了一条常规流程：采集脑脊液、使用下一代测序（NGS）进行ctDNA检测、报告结果并指导中枢神经系统特异性治疗（补充图10）。
3. 包括后续治疗情况在内的临床病理数据被强制记录在预先设计的表格中。
4. 由此生成了一个大型的脑脊液ctDNA临床病理基因组数据集。
5. 腰椎穿刺的指征包括对疑似脑膜转移的神经症状和体征进行临床评估、根据RECIST v.1.1标准评估中枢神经系统转移的进展以寻找耐药机制，以及为肿瘤或血浆提供补充分子诊断，特别是在未经治疗的中枢神经系统转移患者中。
6. 我们报告了一个初始队列，包含2016年7月至2021年9月期间在广东省人民医院的584名患者。
7. 总体而言，其中122名患者进行了连续脑脊液采样。
8. 匹配的肿瘤组织可供302名患者使用。
9. 此外，2021年11月至2023年9月期间，在广东省人民医院还收集了106份脑脊液样本作为验证队列。

Para_02

1. 本研究遵守所有相关的伦理规定，并获得广东省人民医院机构审查委员会的批准（协议编号：KY-N-2022-112-01）。
2. 所有患者均在知情的情况下同意为临床和研究目的提供样本并接受治疗。

Para_03

1. 我们使用了‘性别’这一术语，它是患者入院时自行报告的。
2. 已获得患者同意进行个体数据分析。
3. 我们报告这一特征仅用于描述人口的基本特征，与本文的结果无关。

Clinical annotation and data curation

临床注释和数据整理

Para_01

1. 完整的临床信息，包括与脑脊液时间匹配的人口统计数据、肿瘤组织的病理报告和脑脊液的细胞学报告，均通过人工收集和标注，涵盖所有患者。
2. 根据脑脊液细胞学检测和增强磁共振成像（MRI）结果，诊断是否存在脑膜转移（LMs）或脑转移（BMs）。
3. 脑膜转移定义为脑脊液细胞学阳性、离心后的脑脊液中存在肿瘤细胞，或在MRI上显示软脑膜、颅神经根或室管膜的典型增强表现，或同时具备细胞学和影像学特征。
4. 脑转移仅指MRI显示的实质病灶受累。
5. 对于同时存在脑转移和脑膜转移的患者，归类为脑膜转移，因为这是一种与更高死亡风险相关的并发症。
6. 在脑脊液采集前后收集了治疗背景数据。
7. 疾病状态定义如下：新诊断、仅限中枢神经系统（CNS）、系统性和颅外进展（根据RECIST v.1.1标准）。
8. 转移负担定义为患者临床过程中受影响的不同器官部位数量。
9. 转移器官数量≥3（中位值）定义为高转移负担，转移器官数量<3（中位值）定义为低转移负担。

Para_02

1. 根据临床实践的常规流程，基于脑脊液、血浆和肿瘤组织的结果提供治疗方案。
2. 然而，对于仅在中枢神经系统（CNS）进展的患者，配对的肿瘤或血浆检测并非强制要求，除非基于临床需要提出请求。
3. 脑脊液循环肿瘤DNA（ctDNA）匹配的靶向治疗仅基于脑脊液ctDNA数据进行回顾性分析：即在ctDNA测序后首次系统治疗，针对在脑脊液中检测到的可操作驱动基因或已知耐药机制。
4. 尽管已建立包含密切和定期随访的临床流程，相关信息仍为回顾性收集。
5. 治疗方案分为三种情况：标准治疗、超适应症用药和临床试验。
6. 由于晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者在接受先前全身治疗后常发生或进展为中枢神经系统转移，且缺乏标准治疗，因此在我们的队列中经常观察到超适应症药物使用。
7. 我们分析中的超适应症用药情况包括：无明确用于肺癌或其亚型的适应症、联合用药和/或剂量与批准的适应症不同，或者使用方式与批准的适应症不同。
8. 九名患者参与了临床试验。
9. 所有这些试验均已发表（AZD3759、CTONG1702、NCT03574402-ARM8；艾替尼布、NCT02590952；厄洛替尼+贝伐单抗、CTONG-1509、NCT02759614；SAF-189s、NCT04237805用于ROS1），但SCC244试验（NCT03466268）的终点与我们的分析结果无关。

Brain MRI evaluation

脑部MRI检查

Para_01

1. 由至少一名具有癌症影像经验的放射科医生手动审查了时间匹配、对比增强的脑部磁共振成像扫描（MRI脑脊液采集时间间隔≤30天）。
2. 由于CT和18FDG PET–CT在检测脑转移瘤和软脑膜转移方面的灵敏度较低，因此未纳入分析。
3. 根据神经肿瘤脑转移反应评估标准（RANO-BM），肿瘤大小计算为最多五个目标脑病灶最长直径的总和（SLD）。
4. 除非另有说明，否则仅计算可测量的病灶数量作为肿瘤数目。
5. 使用脑部MRI图像中至少两个可用断面（冠状位、正中矢状位和横断位中的任意两个）来审查和评估脑实质中的肿瘤位置。
6. 通过对比增强T1成像确认软脑膜受累情况。
7. 在386名具有时间匹配MRI扫描的患者中，205名至少有一个可评估的脑部病灶，132名仅有不可评估的病灶，49名通过MRI检查未发现中枢神经系统转移（其中37名仅有阳性脑脊液细胞学结果，提示颅内播散；12名无中枢神经系统转移）。

CSF ctDNA preparation

脑脊液循环肿瘤DNA制备

Para_01

1. 通过腰椎穿刺在床边收集脑脊液，并将其转移到 Streck 无细胞 DNA BCT 管中，然后进行脑脊液 ctDNA 的制备。
2. 脑脊液以 1,900g 离心 10 分钟，随后在 4°C 下以 16,000g 离心 10 分钟，之后将 4-5 毫升的脑脊液上清液转移到新管中。
3. 使用 QIAamp Circulating Nucleic Acid 试剂盒提取 DNA。
4. 使用 Qubit 2.0 荧光计和 dsDNA HS 试剂盒对 cfDNA 进行定量分析。

Para_02

1. 对于验证队列，过程相同，只是脑脊液以 1,800g 离心 10 分钟，随后以 20,000g 离心 10 分钟。

Tumor DNA extraction

肿瘤DNA提取

Para_01

1. 使用 QIAamp DNA FFPE 组织试剂盒（QIAGEN）提取 DNA，操作步骤遵循制造商的说明。
2. DNA 的浓度通过 Qubit dsDNA 检测试剂盒（Life Technologies）进行测量。

Germline DNA

种系DNA

Para_01

1. 全血收集在 Streck 无细胞 DNA BCT 管中。
2. 白细胞被分离并用于基因组 DNA 提取（DNeasy Blood & Tissue Kit，QIAGEN），作为胚系对照。
3. 对于验证队列，使用 MagPure Tissue & Blood DNA LQ 套件（Magen）进行 DNA 提取。

NGS library preparation

下一代测序文库制备

Para_01

1. 使用 M220 Focused-ultrasonicator (Covaris) 对 DNA 进行片段化处理，随后进行末端修复、磷酸化和接头连接。
2. 仅对组织 DNA 进行片段化处理。
3. 通过 AMPure 磁珠 (Agencourt AMPure XP kit; Beckman Coulter) 选择 200–400 bp 大小的片段，随后与捕获探针杂交，并通过磁珠进行杂交选择和 PCR 扩增。
4. 最后，进行高灵敏度 DNA 检测以评估所有片段的质量和大小。
5. 使用 Illumina Nextseq500 测序仪 (Burning Rock Biotech) 进行配对末端测序，或使用 Illumina HiSeq4000 平台 (南京 Geneseeq Technology) 对加索引的样本进行测序。
6. 对于验证队列，DNA 文库在 MGI DNBSEQ-T7 平台上 (MGI Tech Co., Ltd.) 进行测序。

Targeted capture and sequencing

目标捕获与测序

Para_01

1. 我们使用了四个之前建立的基于肿瘤学的下一代测序（NGS）面板，这些面板分别涵盖了168、520（燃石生物）、139和425（南京世和基因）个基因的蛋白编码外显子，用于检测与癌症相关的基因组异常，包括突变、拷贝数变异（CNVs）、小片段插入或缺失（indels）以及结构变异（基因列表见补充表10）。
2. 每份样本的肿瘤和脑脊液（CSF）DNA通过其中一项检测进行测序。
3. 在不了解肿瘤分子改变的情况下，我们在脑脊液中识别出了与肿瘤相关的DNA。

Para_02

1. 验证队列中的 CSF ctDNA 样本使用另一种定制的下一代测序（NGS）检测进行测序，该检测捕获了 86 或 654 个基因的蛋白编码外显子（康辉生物科技有限公司），涵盖了预后模型中感兴趣的基因。

Sequencing data analysis

测序数据分析

Para_01

1. 使用 Trimmomatic 对测序数据进行分析，以去除低质量（质量<15-25）或 N 基序列。
2. 随后，利用 Burrows–Wheeler aligner 将数据映射到人类基因组（hg19）。
3. 通过 Picard 移除 PCR 重复项。
4. 使用 Genome Analysis Toolkit (GATK) 和 MuTect（均来自 Broad 研究所）以及 VarScan（Genome Institute）软件进行局部比对优化、变异检测和注释。

Para_02

1. 使用 VarScan 过滤管道对变异进行了过滤。
2. 深度小于 100 的位点被过滤掉。
3. 对于脑脊液和组织样本中的插入缺失，分别需要至少 2 个和 5 个支持性读段；而对于单核苷酸变异（SNVs），脑脊液和组织样本均需要 8 个支持性读段才能进行呼叫。
4. 基因的选定外显子和内含子被捕获。
5. 我们的目标是使所有靶向区域在组织样本中的平均测序深度达到 2,000 倍，在脑脊液循环肿瘤 DNA (ctDNA) 中至少达到 4,000 倍，而在验证队列中脑脊液的平均深度超过 3,000 倍。
6. 根据 Exome Aggregation Consortium、1000 Genomes Project、dbSNP 和 ESP6500SI-V2 数据库，群体频率大于 0.1% 的变异被归类为单核苷酸多态性（SNPs），并从进一步分析中排除。
7. 通过内部生成的全血样本正常池中的反复出现的假象列表，对所得突变列表进行了进一步过滤。
8. 剩余的变异使用 ANNOVAR 和 SnpEff v.3.6 软件进行注释。
9. DNA 易位分析使用 Tophat2（约翰霍普金斯大学计算生物学中心和华盛顿大学基因组科学系）和 Factera 1.4.3 进行。

Para_03

1. 通过我们内部的分析脚本，基于捕获区间覆盖深度数据检测到了拷贝数变异（CNV）。
2. 覆盖数据经过校正，以消除由于GC含量和探针设计导致的测序偏差。
3. 所有捕获区域的平均覆盖率被用来将不同样本的覆盖率归一化到可比较的尺度。
4. 拷贝数是根据肿瘤样本与足够数量（n > 50）无CNV样本在每个捕获区间上的覆盖深度比值计算得出。
5. 如果基因区域的覆盖率数据与其参考对照相比，在定量上和统计学上均显著不同，则报告该基因的CNV。

Para_04

1. 需要注意的是，我们使用的测定方法已经在多篇先前的文献中报道过。
2. 在四个测定以及验证队列所使用的测定中，遵循了类似的分析流程。

Reconstruction of phylogenetic relationship

系统发生关系的重建

Para_01

1. 同样，根据 TRACERx 肾脏研究中描述的方法，我们使用我们的靶向测序数据来重建系统发育关系。
2. 高测序覆盖度和专门设计的包含425个基因的基因 panel 可以有效丰富驱动事件并减少系统发育重建中的错误。
3. 值得注意的是，检测低频罕见突变的能力、较低的成本以及在临床环境中的可用性可能使靶向测序比全外显子组测序更具优势。

Para_02

1. 通过 PyClone 估计癌细胞比例 (CCFs)，并根据 ABSOLUTE 输出调整肿瘤纯度，以及根据 FACETS 输出的局部拷贝数进行校正。
2. PyClone（v.0.13.0）在默认设置下运行了 1,000 次迭代和 1,000 次预热。
3. 为每位患者生成了一个配置文件，使用总拷贝数选项。
4. PyClone 的其他参数设置如下：α = 1，β = 1，浓度 = 1，先验形状 = 1.0 和速率 = 0.001。
5. 在样本中 CCFs > 0.02 的簇被认为是存在的。
6. 在变异检测步骤中调用的突变进一步基于它们所属的簇是否存在进行过滤。

Para_03

1. 通过使用 PyClone 估计的每个体细胞突变的细胞比例作为输入，利用 SCHISM46 重建了克隆的系统发育树。
2. 在顺序模式下运行 SCHISM（v.1.1.2），并采用 k-means 算法。
3. 相关参数设置如下：代数计数 = 50，种群规模 = 1,000，随机对象分数 = 0.2，突变概率 = 0.9 和适应度系数 = 5.0。
4. 利用 R 包 Phangorn47 和每个样本中单核苷酸变异事件的存在或缺失矩阵重建了样本的系统发育树。

Genomic analyses

基因组分析

Para_01

1. 除非另有声明，否则评估检测频率大于5%的复发性基因组改变，包括单核苷酸变异和拷贝数变异。
2. 对于基因水平的改变分析，仅包含使用涵盖感兴趣基因的检测方法进行测序的样本。

Para_02

1. 在匹配分析中，如果变异仅出现在某一位患者的脑脊液样本或肿瘤样本中，则将其定义为私有变异。
2. 共享变异被定义为在同一患者的脑脊液和肿瘤样本中均出现的变异。
3. 对于配对肿瘤的分析，我们排除了循环肿瘤DNA (ctDNA) 或肿瘤测序结果为阴性的患者。
4. 通过最大等位基因频率 (VAF) 估计肿瘤比例，该比例根据已确认体细胞变异的最高等位基因频率来定义，无论其驱动状态如何。

Para_03

1. 非小细胞肺癌的脑转移基因组数据来自三篇已发表的文章，用于分析其与脑脊液ctDNA的一致性（图4a和扩展数据图3）。
2. 感兴趣的基因仅包括那些在所有检测方法和文献中均涵盖的基因（如适用）。

Statistical analysis

统计分析

Para_01

1. 使用 Fisher 精确检验比较分类变量，使用 Wilcoxon 秩和检验比较连续变量。
2. 多变量逻辑回归分析采用脑脊液 ctDNA 检测结果以及补充表 3 中列出的多个协变量进行。
3. 所有预测因子同时输入回归模型。
4. 使用双侧 Spearman 相关系数 (R) 分析脑脊液 ctDNA 最大 VAF 与肿瘤大小之间的关系，以及脑脊液 ctDNA 和肿瘤之间的基因组构成差异。
5. 总生存期 (OS) 从首次脑脊液采集时间开始计算，至死亡时间或最后一次随访日期（2023 年 4 月；该定义参考了其他使用基于 DNA 测序的脑脊液液体活检的研究）。
6. 使用对数秩检验评估生存差异。
7. Cox 比例风险模型用于计算风险比 (HRs)、置信区间 (CIs) 和 P 值。
8. 使用 Kaplan-Meier 方法可视化时间-事件变量。
9. 除非另有说明，P < 0.05 被认为具有统计学意义。
10. 使用 Benjamini-Hochberg 方法进行多重比较校正，除非另有说明，q 值 < 0.05 被认为具有统计学意义。
11. 统计分析使用 IBM SPSS Statistics v.26 进行。

Construction of the CSF ctDNA-focused prognostic model

构建以脑脊液ctDNA为重点的预后模型

Para_01

1. 所有参与者以 1:1 的比例随机分配到训练队列和测试队列中。
2. 关于脑脊液 ctDNA 为重点的预后模型，多个特征被纳入单变量 Cox 回归分析，这些特征包括临床因素（图 3d 中与总生存期最显著相关的前四项）、脑脊液 ctDNA 检测以及在脑脊液特有队列中检测率高或富集的基因组学特征。
3. 在训练队列中，与生存相关的变量（P < 0.1）随后被纳入多变量 Cox 回归分析。
4. 最终，多变量 Cox 模型中 P 值小于 0.05 的特征被缩减为五个独立指标：RB1 突变、脑脊液 ctDNA 状态、ECOG 性能状态、转移负担和全身进展。
5. 这五个因素根据每个死亡风险比 (HR) 使用以下公式开发了模型。

Para_02

Para_03

1. 使用中位风险指数值作为临界值，将患者分为高危组和低危组。
2. 然后在测试队列和另一个独立验证队列中对该模型进行了验证。
3. 随后，通过逐步减少特征的数量，构建了包含和不包含临床特征的脑脊液ctDNA相关模型。
4. 模型性能通过留一法交叉验证使用一致性排名（C-index）进行评估。
5. 模型的建立和C-index计算是使用R v.4.2完成的。

Reporting summary

报告摘要

Data availability

Para_01

1. 本文报道的脑脊液和肿瘤的原始序列数据已存储在中国国家生物信息中心/中国科学院北京基因组研究所国家基因组数据中心的基因组序列存档库（GSA）中，人类访问号为HRA007298，公众可通过https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human获取这些数据以及如何访问本文原始测序数据的详细信息。
2. 进行分析所需的临床和病理数据在正文和补充信息中提供。
3. 本论文提供了源数据。

Code availability

Para_01

1. 定制代码可以在 https://github.com/Github0409584/CSFctDNA、SCHISM（https://github.com/KarchinLab/SCHISM）和 PyClone（https://github.com/Roth-Lab/pyclone）中获取。