**摘要：**间充质基质/干细胞（MSC）由传统2D贴壁培养转向3D微载体生物反应器时，细胞产量提升并不自动意味着产品质量保持一致。培养模式改变可能影响细胞的生长动力学、分化状态、免疫调节功能及分泌谱，因此需要建立适当的工艺可比性评价体系。RoosterBio公开的MSC生物工艺研究将群体倍增水平（PDL）作为比较细胞扩增历史的重要指标，并在相近PDL条件下评价2D与3D培养细胞的关键质量属性（CQA）。本文结合hUC-MSC相关会议研究、2020年《Bioengineering》发表的微载体工艺数据及厂家技术资料，分析PDL与PDT的区别、2D/3D工艺转换中的主要漂移因素，以及如何结合表面标志物、三系分化、IDO诱导和细胞因子分泌谱建立多维度可比性证据。

**关键词：MSC 2D/3D可比性、间充质基质细胞、MSC规模化培养、群体倍增水平、PDL、PDT、关键质量属性、CQA、产品漂移、IDO免疫调节、三系分化、微载体生物反应器**

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## 一、为什么MSC从2D改成3D以后，不能只比较细胞产量

MSC工艺从研发进入中试及规模化制造时，传统2D细胞培养瓶或多层细胞工厂通常需要逐步向3D微载体生物反应器转移。两类体系都能够扩增MSC，但其细胞生长环境并不完全相同，因此不能只根据最终收获细胞数量判断工艺转换是否成功。

在2D体系中，细胞主要贴附于培养容器表面生长，培养环境受到培养面积、汇合度、换液和消化操作等因素影响。进入3D微载体反应器以后，细胞需要附着在悬浮微载体表面，同时受到混合、剪切、氧传递、pH、补料以及收获方式等更多过程参数影响。

如果这些变量发生变化，最终细胞可能仍然表达常用MSC表面标志物，却在增殖、分化潜能、免疫调节功能或细胞因子分泌方面表现不同。因此，所谓的产品漂移（Product Drift）并不一定意味着细胞身份已经完全改变，也可能体现为某些关键质量属性出现不同程度的偏移。

RoosterBio公开资料将MSC制造中的主要漂移风险归纳为工艺、供体和规模三个方面。

| 漂移来源 | 典型表现 | 监管/产业后果 |
| :---: | :---: | :---: |
| 工艺漂移 | 培养模式切换（2D→3D）、培养基批源变化、消化方式差异、汇合时间偏移 | CQA（标志物、分化、IDO、细胞因子）变化→可能改变MoA |
| 供体变异 | 不同donor间扩增能力、最终密度、扩增倍数差异大 | 多供体商业化的批间稳定性挑战 |
| 规模漂移 | 反应器构型切换（0.1L→15L→50L→200L）中的剪切、传质、DO/pH微环境差异 | 放大过程可能引入新的产品属性漂移 |

**表1：MSC规模化培养中可能出现的三类产品漂移来源**

![MSC规模化中的三类产品漂移来源](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/7ba5f9cf6ba68b9e89894e0680b5add1.jpg)

**图1：MSC规模化中的三类产品漂移来源**

这三类风险之间并不是完全独立的。例如，某个供体在2D条件下增殖良好，但在3D微载体中表现较差，可能同时涉及供体差异和培养工艺适应性。因此，建立2D/3D可比性研究时，需要尽量固定细胞来源和起始状态，再比较不同培养方式产生的变化。

## 二、为什么RoosterBio使用PDL作为2D/3D比较的重要指标

群体倍增水平（Population Doubling Level，PDL）用于描述细胞群体的累计扩增历史，是MSC制造和细胞年龄管理中的常用指标。

对于一个特定扩增阶段，可以通过收获细胞数量与接种细胞数量的比值计算该阶段的群体倍增数，再结合此前培养阶段的记录获得累计PDL。

其核心逻辑是：细胞经历的累计扩增历史，不一定能用传代次数或者最终培养密度完整表达。

例如，两个MSC培养体系可能都进行了三次传代，但由于每次接种密度、扩增倍数和收获时间不同，最终累计PDL并不一定相同。反过来，在不同培养体系中，如果能够追踪并控制累计PDL，就可以减少因细胞扩增历史不同而引入的部分干扰。

但PDL也不能直接等同于细胞衰老程度。它描述的是群体扩增历史，而不是对端粒状态、细胞衰老相关表型或者全部功能属性的直接检测。因此，更合理的做法是将PDL用作实验设计中的比较基准，再通过实际CQA检测判断细胞状态。

RoosterBio公开的2D/3D研究采用这一思路：尽量在相近最终PDL条件下比较两种培养体系产生的MSC，而不是只看收获时的总细胞数量或者培养容器规格。

这一设计的价值，是让研究人员能够进一步判断，当细胞扩增历史相对可比时，培养方式本身是否造成了额外质量变化。

## 三、PDL、PDT和扩增倍数为什么不能混为一个指标

在MSC工艺开发中，经常同时使用PDL、PDT和扩增倍数描述细胞生长，但它们回答的问题并不完全相同。

PDL是Population Doubling Level，强调细胞群体累计经历的扩增水平；PDT是Population Doubling Time，强调完成一次群体倍增所需要的时间；扩增倍数则反映某一培养阶段收获细胞数量与投入细胞数量之间的比例。

其中，某个单独培养阶段的扩增倍数与该阶段群体倍增数存在数学关系。如果在相同起点、相同计数口径下比较，两者并不是彼此独立的生物学变量。

但当研究跨越多个培养阶段时，累计PDL还包含此前细胞库建立和扩增过程中积累的倍增历史。因此，只记录当前反应器阶段的扩增倍数，并不能完整代表细胞从早期培养开始的累计PDL。

PDT则描述增殖速率。即使两个细胞批次最终达到相近PDL，它们到达该终点所需的培养时间也可能不同。

因此，MSC制造中至少需要同时记录三个方面：细胞进入当前工艺之前已经积累的PDL、当前阶段的扩增情况，以及细胞达到目标终点所需的时间。

原始资料中的RoosterBio工艺在特定培养条件下报告了相近的PDT和PDL结果，但不能据此得出“PDT只由培养基决定，永远不会受到2D或3D培养模式影响”的一般结论。细胞来源、环境条件和过程参数仍然可能影响实际增殖速率。

## 四、2D与3D工艺可以怎样建立相近的细胞扩增终点

RoosterBio公开的2020年研究及相关工艺资料列出了2D与3D培养条件的参考参数。对于2D培养，原稿使用约3,000 cells/cm²作为接种密度；对于3D微载体培养，列出约2.3×10⁴ cells/mL，对应约4,667 cells/cm²的等效面密度。

在所研究的体系中，两类培养方式的PDT均约为24小时，最终工艺通过控制扩增历史，使细胞在预期PDL范围内完成培养。

| 参数 | 2D推荐值 | 3D推荐值 | 一致性逻辑 |
| :---: | :---: | :---: | :---: |
| 接种密度 | 3,000 cells/cm² | ≈ 2.3×10⁴ cells/mL（约4,667 cells/cm² 等效面密度） | 不同模式匹配不同基质 |
| PDT（群体倍增时间） | ≈ 24h | ≈ 24h | 由培养基配方决定，不随模式改变 |
| “一代”定义 | 细胞每消化一次，代次加1 | 细胞每消化一次，代次加1 | 收获得率由PDL推导 |
| 最终PDL终点 | 工艺目标锁定 | 工艺目标锁定 | CQA可比的锚点 |

**表2：原始工艺资料中2D与3D培养的参考参数及比较逻辑**

需要说明，表中“PDT由培养基配方决定，不随模式改变”是原始工艺资料的概括性表述。更严谨的理解是：在该研究所采用的细胞和培养条件下，2D与3D获得了相近的PDT，不能将其作为所有培养模式均不影响PDT的普遍规律。

另外，传代次数与PDL也需要明确区分。一次消化和重新接种可以使记录中的传代次数增加，但该培养阶段实际发生了多少次群体倍增，仍需要通过细胞数量和累计扩增历史进行计算。

因此，这张表最值得参考的不是某个可以直接复制的通用参数，而是其比较原则：不同培养模式可以分别建立适合自己的接种方式，但最终应在可比的细胞扩增历史下开展质量评价。

## 五、2D与3D可比性研究具体比较了哪些细胞质量属性

MSC培养模式发生变化以后，需要进一步确认细胞身份和功能是否仍然符合研究目标。

RoosterBio公开的hUC-MSC 2D/3D可比性研究，结合2020年《Cytotherapy》会议摘要及相关技术资料，比较了细胞生长、表面标志物、三系分化、免疫调节和分泌谱等指标。

在细胞身份方面，研究涉及CD90、CD166等阳性标志物及CD34、CD45等阴性标志物；在分化潜能方面，比较了成骨、成脂和成软骨三系分化；在功能方面，分析了IDO诱导反应以及VEGF、IL-8、bFGF、HGF、TIMP1和TIMP2等血管生成相关因子。

![RoosterBio 2D与3D培养MSC的CQA比较维度](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/ead15476bbbb9bdac6f572e1cd19a495.jpg)

**图2：RoosterBio在2D与3D培养细胞之间比较的表面标志物、分泌谱、免疫调节和三系分化指标。**

这些指标并不是为所有MSC产品建立了一套固定的统一放行标准，而是在研究中用来观察不同培养模式是否引起细胞属性变化。

如果研究目标涉及免疫调节作用，IDO等功能相关指标就具有较高的解释价值；如果项目更关注组织修复或其他生物学作用，则应根据预期作用机制选择相应的功能评价方法。

因此，真正合理的CQA研究应与目标产品的特性和作用机制相联系，而不是简单增加检测项目数量。

## 六、为什么表面标志物一致，仍不足以证明MSC功能一致

MSC表面标志物检测通常是识别细胞身份的重要手段，但它并不能完整描述细胞的所有功能。

例如，两组MSC都能够表达CD90、CD166，并且CD34、CD45维持阴性，并不意味着它们一定具有完全相同的免疫调节能力、分泌谱或分化潜能。

培养环境发生改变以后，细胞可能仍然保持典型表面标志物，却在受到特定刺激后的功能响应方面出现差异。因此，RoosterBio相关研究没有只停留在流式细胞术分析，而是进一步开展三系分化及功能评价。

在三系分化方面，成骨、成脂和成软骨诱导可以帮助研究人员确认所获得的细胞是否保留相关分化能力。但分化染色结果的可比性仍然需要结合相同诱导条件和评价口径理解。

在免疫调节方面，研究将IDO作为一个重要检测对象。IDO是吲哚胺2,3-双加氧酶，在部分MSC免疫调节研究中，可通过IFN-γ刺激后观察其诱导相关表现，并使用kynurenine等指标开展评价。

这类功能检测比单独观察细胞身份标志物提供了额外信息：它不仅描述细胞“是什么”，还进一步分析细胞在特定刺激下“能够做出怎样的反应”。

不过，IDO诱导表现仍然不能独立替代所有免疫调节功能评价，也不能自动代表特定临床适应场景中的实际效力。

## 七、VEGF、IL-8、bFGF和HGF等分泌因子为什么值得纳入比较

MSC的生物学作用除细胞自身状态以外，还可能涉及其释放的多种细胞因子和其他分泌组分。因此，在比较2D与3D培养结果时，分泌谱也是判断培养环境是否影响细胞功能状态的一个重要维度。

原始资料中的研究分析了VEGF、IL-8、bFGF、HGF、TIMP1和TIMP2等因子。这些分子涉及血管生成调节、组织微环境及相关生物学过程，因此可作为特定功能方向的比较指标。

如果两组MSC的表面标志物相近，但这些分泌因子的表达或释放水平出现明显差异，就说明两种培养条件可能影响了细胞的分泌状态，需要进一步分析其原因及实际意义。

反过来，如果在相同检测条件下，2D与3D培养细胞表现出相近的分泌谱，则可以为工艺可比性增加一类证据。

需要强调，分泌因子的高低并不一定存在适用于所有产品的统一最优方向。例如，某一种细胞因子在特定研究中具有积极意义，不代表其浓度越高就一定意味着最终MSC产品质量越好。

因此，这类数据更适合用于特定项目的功能可比性分析，而不是脱离产品用途进行简单排序。

## 八、已有研究是否支持在相近PDL下获得可比的CQA

原稿引用了三类与RoosterBio 2D/3D可比性有关的证据。

第一类是Adlerz等发表于《Cytotherapy》2020年会议增刊的hUC-MSC研究摘要。该研究关注无异源成分的生物反应器工艺，并比较了2D与3D条件下的细胞生长及质量属性。公开摘要支持在一致PDL基础上评价不同培养方式的细胞可比性。

第二类是RoosterBio团队在ISCT 2019展示的相关会议资料，比较内容涉及生长速率、PDL、流式表型、三系分化、免疫调节及血管生成相关细胞因子。

第三类是Lembong等2020年发表于《Bioengineering》的微载体培养研究。该研究建立了无异源成分的补料分批培养工艺，在5天培养中获得约2×10⁵至6×10⁵ cells/mL的最终细胞密度，并报告最终累计PDL位于16–20范围；同时使用多个供体评价细胞的后续扩增、表型和功能相关属性。

这三类资料在证据性质上并不完全相同。其中，《Bioengineering》论文属于正式发表的研究论文，而《Cytotherapy》相关内容及ISCT资料包含会议摘要或会议展示结果。因此，不能把所有结果都当作同等完整的同行评审实验报告。

综合这些资料，可以认为RoosterBio已在特定MSC来源和工艺条件下提供了2D/3D相关可比性证据。

但研究中的“CQA可比”并不意味着所有质量指标的数值必须完全相同，也不能保证其他供体、其他培养基或其他微载体反应器采用相近PDL后一定得到相同结论。

## 九、MSC可比性研究可以采用怎样的多维评价框架

根据原稿列出的研究指标，可将2D/3D可比性评价整理为以下框架。

| 比较维度 | 关键指标 | 工具/方法 |
| :---: | :---: | :---: |
| 细胞身份 | ISCT三阴三阳+CD166 | 流式细胞术 |
| 分化潜能 | 骨/脂/软骨三系分化 | 诱导分化染色 |
| 免疫调节 | IDO活性（IFN-γ诱导） | kynurenine测定 |
| 分泌谱 | VEGF/IL-8/bFGF/HGF/TIMP1/TIMP2 | 多因子检测 |
| 体内效力 | 小鼠模型效价 | 疾病模型 |

**表3：MSC从2D转3D时可参考的五类质量评价维度**

表中前四类指标在原稿引用的2D/3D研究和相关技术资料中具有直接对应的研究内容。第五类体内效力属于可根据具体产品增加的评价方向，不应理解为所列2D/3D研究均已通过同一种小鼠疾病模型完成体内效力验证。

此外，具体的接受标准、检测重复次数以及不同批次允许的变化范围，都需要结合目标细胞产品建立。不能仅依据某个厂家在特定研究中观察到可比结果，就直接把这五类指标视为所有MSC产品共同适用的监管要求。

## 十、PDL匹配之后，还需要怎样理解工艺可比性的边界

PDL是一项有价值的工艺记录和比较指标，但不是能够独立预测全部MSC质量的指标。

如果两组细胞最终PDL相近，却采用不同的培养基、微载体、剪切条件和收获方法，那么这些变量仍然可能对细胞状态产生影响。因此，PDL匹配更适合被理解为减少细胞扩增历史差异的一种实验设计方法，而不是对所有CQA保持一致的保证。

同样，分析检测结果相近，也不等于已经证明临床效果完全可比。对于需要进一步进入临床研究或发生重要工艺变更的细胞产品，还需要根据项目实际情况评价可比性证据是否足以覆盖预期的质量和功能风险。

RoosterBio的研究提供了一条值得参考的技术路径：先建立可追踪的细胞扩增历史，再在相近PDL条件下完成2D/3D培养，最后利用身份、分化和功能数据判断培养方式变化带来的影响。

这一思路比只比较细胞产量更适合回答真正的工艺转移问题。

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## 十一、总结

MSC从2D贴壁培养转向3D微载体生物反应器以后，工艺是否成功不能只由最终细胞密度或扩增倍数决定。

由于不同培养模式会改变细胞接触的基质、混合环境、氧传递和收获方式，研究人员需要进一步确认产品关键质量属性是否保持在可接受范围。

RoosterBio相关研究将PDL作为细胞扩增历史的重要比较指标，并在相近PDL条件下分析2D与3D培养细胞的表面标志物、三系分化、IDO诱导及细胞因子分泌谱。2020年的微载体研究还在特定无异源培养体系中报告了最终PDL 16–20、5天培养达到2×10⁵至6×10⁵ cells/mL的结果。

这些数据说明，在经过合理设计和验证的工艺条件下，2D与3D培养细胞可以建立一定程度的质量可比性证据。

但PDL一致不等于所有生物学属性自动一致，PDT也不应被视为完全不受培养模式和过程条件影响的固定值。

因此，MSC 2D/3D工艺转换中的评价逻辑可以概括为：

**细胞来源及初始状态 → 累计PDL和PDT记录 → 不同培养模式的过程参数 → 细胞身份与分化 → 免疫调节与分泌谱 → 目标产品相关功能。**

真正值得关注的不是让2D与3D使用完全相同的操作参数，而是通过合理控制和多维度检测，证明不同培养方式得到的MSC仍然满足目标产品的质量与功能要求。

## 参考文献

[1] Adlerz K, Takacs JD, Kirian R, Trempel M, Rowley JA, Ahsan T. A scalable and xeno-free bioreactor system for biomanufacturing of hUC-MSCs. Cytotherapy. 2020;22(5 Suppl):S46–S47. DOI: 10.1016/j.jcyt.2020.03.052.

[2] Lembong J, Kirian R, Takacs JD, Olsen TR, Lock LT, Rowley JA, Ahsan T. Bioreactor Parameters for Microcarrier-Based Human MSC Expansion under Xeno-Free Conditions in a Vertical-Wheel System. Bioengineering. 2020;7(3):73. DOI: 10.3390/bioengineering7030073.

[3] RoosterBio. Advances in Clinical Translation & Scale-up of MSCs & Extracellular Vesicles at ISCT 2019. RoosterBio Blog.

[4] Kirian R. Maintaining CQAs as Manufacturing Processes are Scaled from 2D to 3D Bioreactor Culture. RoosterBio. 2022.

> 本文基于RoosterBio公开生物工艺资料、同行评审研究论文及会议资料整理，用于MSC 2D/3D培养、群体倍增水平PDL、群体倍增时间PDT和关键质量属性CQA评价等方向的科研技术参考。文中接种密度、约24小时PDT、16–20 PDL及相关CQA结果均对应特定细胞来源和培养工艺，不构成所有MSC产品的通用工艺标准。PDL匹配可以辅助设计可比性研究，但不能替代细胞身份、功能及其他质量属性的实际验证。


摘要：间充质基质/干细胞（MSC）由传统2D贴壁培养转向3D微载体生物反应器时，细胞产量提升并不自动意味着产品质量保持一致。培养模式改变可能影响细胞的生长动力学、分化状态、免疫调节功能及分泌谱，因此需要建立适当的工艺可比性评价体系。RoosterBio公开的MSC生物工艺研究将群体倍增水平（PDL）作为比较细胞扩增历史的重要指标，并在相近PDL条件下评价2D与3D培养细胞的关键质量属性（CQA）。本文结合hUC-MSC相关会议研究、2020年《Bioengineering》发表的微载体工艺数据及厂家技术资料，分析PDL与PDT的区别、2D/3D工艺转换中的主要漂移因素，以及如何结合表面标志物、三系分化、IDO诱导和细胞因子分泌谱建立多维度可比性证据。

MSC从2D转3D如何判断细胞质量可比？PDL、PDT与CQA评价方法解析

间充质基质/干细胞（MSC）由传统2D贴壁培养转向3D微载体生物反应器时，细胞产量提升并不自动意味着产品质量保持一致。培养模式改变可能影响细胞的生长动力学、分化状态、免疫调节功能及分泌谱，因此需要建立适当的工艺可比性评价体系。RoosterBio公开的MSC生物工艺研究将群体倍增水平（PDL）作为比较细胞扩增历史的重要指标，并在相近PDL条件下评价2D与3D培养细胞的关键质量属性（CQA）。

应用科学家

其他

MSC从2D培养转向3D微载体生物反应器，不能仅以细胞产量评判工艺成功。本文以群体倍增水平（PDL）为比较基准，分析2D/3D转换中的产品漂移因素，结合表面标志物、三系分化、IDO诱导及细胞因子分泌谱建立多维度可比性证据，为MSC规模化制造提供关键质量属性（CQA）评价思路。

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