**摘要：** PEI转染后出现细胞皱缩、脱落或活率下降，需要结合异常出现的时间，检查DNA与PEI用量、转染前细胞状态以及培养条件。本文围绕哺乳动物细胞瞬时转染中的常见问题，说明如何同时评价细胞活率与转染效果，并结合HEK293T细胞的GFP表达图例，梳理小范围条件优化的思路。

**关键词：PEI转染、PEI转染细胞活率下降、HEK293T转染、瞬时转染优化、DNA与PEI比例、聚乙烯亚胺、细胞状态、瞬时蛋白表达**

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## 一、活率下降、细胞结团和碎片增多，先分清发生顺序

PEI（聚乙烯亚胺）是一类用于哺乳动物细胞瞬时转染的阳离子聚合物载体，可与DNA形成复合物。实际实验中，细胞活率下降不宜直接归结为某一个原因：PEI用量、试剂类型、复合物制备、转染前的细胞状态和培养条件，都需要与当前体系对应起来检查。

排查的第一步，是记录异常何时出现。加入复合物后才出现细胞皱缩、脱落，与转染前细胞已经生长不佳，对应不同的检查方向。培养液中的团块和碎片也应分别观察，不能全部当作细胞死亡的直接证据。

| 现象 | 常见出现时间 | 主要排查方向 |
| :---: | :---: | :---: |
| 细胞皱缩、脱落、活率下降 | 加入复合物后数小时至次日 | 复合物用量、细胞状态与培养条件是否匹配 |
| 细胞结团、成簇 | 加入复合物后短时间内，或转染前已存在 | 复合物是否聚集，以及细胞自身的结团状态 |
| 培养液中碎片、絮状物增多 | 可晚于细胞状态变化；部分颗粒也可能在加入细胞前出现 | 区分细胞残留物与试剂、复合物相关颗粒 |

**表1：PEI转染常见异常的观察时间与排查方向。时间先后用于帮助定位问题，不能单独确定原因。**

如果碎片是在细胞状态恶化之后增多，排查重点应回到前面的培养过程；如果混合液尚未加入细胞就出现颗粒或絮状物，则应优先检查试剂配制与复合物制备。先明确这一顺序，再调整转染条件，能够避免把后续现象当作起始原因。

## 二、PEI用量与DNA比例：同时看活率和转染效果

### 1. 用量偏高可能影响细胞状态

PEI与DNA形成复合物后，体系中可能仍存在未与DNA结合的游离PEI，其比例受配制条件影响。游离PEI与细胞状态之间存在用量相关的联系，因此，转染后活率下降时，复合物总用量及PEI与DNA的配比是需要核查的因素。

不同细胞系、线性或支化PEI，以及不同分子量的PEI，适用条件并不相同。即使都属于PEI转染，也不能默认沿用另一种试剂或另一种细胞体系的比例。实验记录应写清所用材料、DNA用量和PEI用量，而不是只留下一个没有定义的比值。

### 2. 减少PEI不一定同时改善转染效果

优化目标是找到细胞活率与转染效果都较合适的条件，而不是单纯追求最低PEI用量。相关研究发现，去除游离PEI可以降低细胞毒性，但在较低DNA用量下，转染效果也可能下降[2]。这一结果说明，游离PEI的影响需要结合完整体系判断，不能简单理解为“越少越好”。

比较条件时，应同时记录细胞活率和对应的转染读数。如果减少PEI后细胞状态改善，但表达信号下降，就需要继续检查细胞基础状态、复合物制备及培养条件，而不是只在同一个比例上反复增减。

### 3. HEK293T图例中的1:2、1:3，要先读准比例方向

下图展示了HEK293T细胞在不同PEI条件下的GFP表达。原图标注为Control、PEI（1:2）和PEI（1:3）；依据对应文献，这里的1:2和1:3表示**DNA:PEI质量比**[1]，不能反写成PEI:DNA质量比。

![HEK293T细胞在对照及DNA:PEI质量比1:2、1:3条件下的GFP表达](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/d16aa6d0f62292280dff7781f8a642ea.jpg)

**图1：不同PEI条件下HEK293T细胞的GFP表达。图中比例按原文献解释为DNA:PEI质量比。来源：Akgöl S等，Gene Editing，2021；2：22–30。**

该图可以帮助理解为什么需要在同一细胞体系中比较用量条件，但它展示的是GFP表达图像，不是细胞活率的定量结果。不能仅根据荧光图像推算活率，也不能把图中的某一比例写成所有细胞和PEI产品都适用的最佳比例。

## 三、转染前的细胞状态，决定了用量比较是否有意义

### 1. 先看生长状态，再看密度

转染前应优先使用处于对数生长期、活率较高的细胞。细胞已经老化、生长不佳，或贴壁细胞汇合度过高时，转染后的状态更容易受到影响。传代次数也应作为背景信息记录，但不能只用代数代替对实际生长状态的观察。

做用量比较时，应尽量固定细胞密度和培养阶段。否则，一组细胞状态较好、另一组已经过密，即使采用不同PEI用量，也难以判断后续差异究竟来自配比还是细胞本身。

### 2. 检查培养液是否已经不适合继续转染

培养液耗竭、营养状态不佳，会增加转染结果解释的难度。若转染前细胞已经表现出状态下降，应先核查基础培养条件，并根据所用培养体系考虑是否更换新鲜培养液。

换液应作为一个明确记录的条件，而不是在不同实验组中随意处理。这样，当细胞活率或表达结果发生变化时，才能判断培养液处理是否也是影响因素。

## 四、转染后什么时候换液？不要把参考时间当作统一要求

转染前更换新鲜培养液，以及转染后**18–24小时**换液，都是需要结合实际流程评估的处理安排。这里的时间范围是操作参考，不是所有PEI产品、贴壁细胞或悬浮细胞都必须执行的统一步骤。

判断是否换液，应结合当前细胞状态、培养方式及所用试剂的适用流程。比较实验中还需要统一换液安排，避免一组更换培养液、另一组不更换，却把全部差异归因于PEI比例。

对于悬浮体系，也不能直接照搬贴壁细胞的操作。具体培养液处理方式应与该细胞体系相匹配，再据此比较换液前后的细胞状态与转染结果。

## 五、如何安排一轮有针对性的PEI转染优化？

先确认细胞生长状态与密度处于可比较的范围，再设置少量条件，摸索DNA用量和PEI与DNA的比例。每组都保留明确的实际用量、比例定义、复合物制备方式及培养处理记录，并同时观察细胞活率和转染效果。

复合物制备流程也应保持一致，包括使用与试剂相容的稀释液、统一制备与使用安排，以及关注混合液是否出现异常浑浊或絮状物。现配现用的目的在于减少不一致的放置过程，并不代表省略所用试剂要求的复合物形成步骤。

![PEI转染实验的小范围优化、基础条件稳定与系统排查流程](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/20bceb2abc17e3e7617a1c66103a0e63.jpg)

**图2：PEI转染优化思路。固定基础条件后比较用量，并结合细胞状态、复合物制备和培养条件解释结果。流程图为排查框架，不代表通用实验参数。**

如果活率与转染效果始终只是一升一降，应重新检查基础条件是否稳定，而不是继续围绕同一个参数调整。后续采用的条件，应对应具体细胞系、PEI类型和培养方式，并能够通过重复实验确认其表现。

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## 常见问题（FAQ）

### 1. PEI转染后细胞活率下降，是否一定是PEI加多了？

不一定。用量和比例是排查因素之一，还需要检查转染前细胞状态、密度、培养液条件以及复合物制备情况。

### 2. 图中的DNA:PEI 1:2，可以直接作为实验起始方案吗？

该比例来自特定HEK293T实验，仅凭图例不足以确定自身体系的起始方案。需要先核对PEI类型、培养方式及适用说明，也不能把比例方向写反。

### 3. 降低PEI用量后活率提高，是否说明优化已经完成？

还需要观察转染效果。如果表达读数同时下降，应继续评估完整条件，而不是仅凭活率选择后续方案。

### 4. PEI转染后必须在18–24小时换液吗？

不是。文中的18–24小时是结合体系评估的参考范围，是否换液及具体时间应与细胞状态、培养方式和试剂流程对应。

## 参考文献

[1] Akgöl S, Yetim E, Kalkan BM, Kocabaş F. Development of gene editing strategies for CCR5 gene in endothelial cells. Gene Editing. 2021;2:22–30. DOI: 10.29228/genediting.54872.

[2] Boeckle S, et al. Purification of polyethylenimine polyplexes highlights the role of free polycations in gene transfer. J Gene Med. 2004;6(10):1102–1111. DOI: 10.1002/jgm.598.

## 关于技术来源

> 本文依据PEI转染技术资料及相关研究文献。图示结果与操作参考均需结合具体细胞系、PEI类型和培养条件解读，供科研实验排查与条件优化参考。

摘要： PEI转染后出现细胞皱缩、脱落或活率下降，需要结合异常出现的时间，检查DNA与PEI用量、转染前细胞状态以及培养条件。本文围绕哺乳动物细胞瞬时转染中的常见问题，说明如何同时评价细胞活率与转染效果，并结合HEK293T细胞的GFP表达图例，梳理小范围条件优化的思路。

PEI转染后细胞活率下降怎么办？用量、细胞状态与培养条件排查

PEI转染后出现细胞皱缩、脱落或活率下降，需要结合异常出现的时间，检查DNA与PEI用量、转染前细胞状态以及培养条件。本文围绕哺乳动物细胞瞬时转染中的常见问题，说明如何同时评价细胞活率与转染效果，并结合HEK293T细胞的GFP表达图例，梳理小范围条件优化的思路。

应用科学家

其他

PEI转染后细胞活率下降，需结合异常出现时间，排查DNA与PEI用量、比例定义、转染前细胞状态及培养条件。优化需同时评估活率与转染效果，关注复合物制备和换液时机，避免单一参数反复调整。HEK293T等体系需明确材料类型与比例方向，以稳定可重复条件为准。

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