文献分享--整合的单细胞和空间转录组学揭示了参与胰腺癌神经侵袭的不同细胞亚型

作者，Evil Genius

今天我们分享文献

知识积累

神经系统作为器官发育、组织稳态和免疫功能的全身调节器，在整个生命过程中成为肿瘤-宿主相互作用的关键组成部分。

结合了sc/snRNA-seq、单细胞T细胞受体测序（scTCR-seq）、ST和多重IHC（mIHC）来描绘PDAC的单细胞和空间分辨图谱。分析揭示了高NI（neural invasion）和低NI（neural invasion）组织之间的细胞组成差异。

结果1、具有低/高神经侵袭状态的人PDAC组织的多组学分析

13个新鲜肿瘤组织、8个相邻正常组织和12个外周血样本进行scRNA-seq和scTCR-seq，使用10X Visium平台对16个代表性FFPE肿瘤样品和5个冷冻肿瘤组织进行ST分析。

结果2、具有不同转录组学和形态学特征的恶性亚群表现出不同的侵袭潜力

PDAC恶性细胞在基因突变、转录程序和组织病理学特征方面表现出显著的异质性。

恶性导管细胞的划分，首先，对所有导管细胞进行了无监督聚类分析。其中D01_Ductal-CFTR亚群特异性高表达非恶性导管细胞标志基因（如外分泌标记物CFTR），提示其具有正常导管功能。通过大规模染色体拷贝数变异（CNV）推断，发现D01_Ductal-CFTR的CNV水平显著偏低，表明其基因组特征正常。相比之下，其他亚群均呈现不同程度的CNV，证实了它们的肿瘤属性。

PDAC分子分型系统目前已基于"经典型（classical）"和"基底样型（basal-like）"亚型建立。将聚类结果与已发表的亚型特征基因集进行比对，发现D09_Ductal-CEACAM6呈现"基底样型"特征，而D08_Ductal-CEACAM5则显示"经典型"特征。D04_Ductal-GABRP和D05_Ductal-PRSS1同时表达经典型与基底样型特征基因，故被归类为"中间型"。值得注意的是，D02_Ductal-APOA2的基因表达模式与最新报道的神经内分泌样特征高度重合。

为探究分子亚型与形态学特征的关联，对空间转录组（ST）数据进行反卷积分析，定位恶性导管亚型占比超过80%的区域。D08_Ductal-CEACAM5表现为典型的管状或拉长腺体形态，符合"经典型"组织学特征；D09_Ductal-CEACAM6则由非腺体样排列的多形性大细胞构成，呈现基底细胞样特征；"中间型"亚型表现为边界不清的腺体结构，伴有显著核异型的未分化细胞；D02_Ductal-APOA2则独具神经内分泌分化特征——丰富的嗜酸性胞浆、圆形规则核仁不明显的细胞核。这种分子特征与形态学表现的高度一致性，进一步验证了聚类分析的合理性。

为探究恶性亚群与神经浸润（NI）特性的相关性，采用比值比（odds ratio）进行分析。结果显示D02_Ductal-APOA2特异性富集于低NI组，而多个亚型在高NI组中显著增多。空间转录组（ST）分析同样证实：富含D02_Ductal-APOA2神经内分泌样细胞的Malignant_ductal_4生态位在低NI组中更普遍。该亚群神经输入信号及其受体表达水平较低，提示其低侵袭性可能不依赖于自主神经信号传导。

相反，D02_Ductal-APOA2特异性高表达APOA2、APOA1、ALB等脂代谢相关基因，并富集脂蛋白颗粒重塑、胆固醇稳态和类固醇代谢等通路，表明其具有活跃的胆固醇代谢和潜在类固醇合成能力，这与其神经内分泌样特征相符。既往研究显示，胆固醇耗竭可使腺泡型胰腺癌向基底样表型转化并激活上皮-间质转化（EMT），提示脂代谢紊乱与PDAC转移相关。与此一致，D02_Ductal-APOA2表现出较低的EMT评分，但其具体机制仍需进一步验证。

在高NI组中，恶性亚群的多样性低于低NI组。值得注意的是，13例高NI组织中的优势亚型同时包含"基底样型"、"中间型"和"经典型"。为解析其与浸润神经的空间关系，分析了神经侵袭前沿（1-5个spot距离内）的亚群分布。结果显示，D09_Ductal-CEACAM6和D04_Ductal-GABRP在紧邻神经（1个spot距离内）的区域出现频率最高。

D09_Ductal-CEACAM6显著富集整合素信号通路、细胞迁移和粘附依赖性细胞铺展等通路，并具有最高EMT评分。与之相符，该亚群中WNT信号通路（已知参与EMT调控）显著激活。同时，编码细胞外基质（ECM）降解蛋白酶CTSA和CTSB的基因在该亚群中上调。这些发现提示，D09_Ductal-CEACAM6可能通过增强组织基质穿透能力促进神经浸润。

研究表明，尽管D09_Ductal-CEACAM6和D04_Ductal-GABRP在转录组学和形态学特征上存在差异，但两者均表现出显著的神经浸润倾向。这提示肿瘤细胞可能通过不同的侵袭策略适应特定的微环境：

• D09_Ductal-CEACAM6依赖EMT和基质降解机制
• D04_Ductal-GABRP通过神经受体介导的互作通路

结果3、低NI和高NI TME之间细胞组成的变化

分析低NI和高NI TME之间的免疫和基质细胞变化，结合观察到的细胞数与预期细胞数的比率（Ro/e）、milloR和非参数统计分析。在免疫细胞区室中，低NI肿瘤组织显示出B03_GCB-RGS13（生发中心B细胞）、B06_plasmablasts-MKI67（增殖性浆母细胞）和B05_PlasmaB-IgG（IgG型浆细胞）的比例显著升高。鉴于生发中心B细胞主要定位于三级淋巴结构（TLS）并可在TLS内分化为浆细胞，推测低NI PDAC组织可能具有更丰富的TLS。空间转录组数据证实了这一假设：构成TLS的核心细胞组分——包括B01_naive-TCL1A（初始B细胞）、B03_GCB-RGS13和T10_CD4_Tfh-like_CXCL13（滤泡辅助性T样细胞）在低NI组织中比例更高。

通过空间生态位的主成分分析（PCA），发现低NI组织形成了独立的聚类群，提示该组别具有共同的微环境特征。具体而言，低NI组织中N01_TLS（TLS生态位）、N04_Plasma-enriched（浆细胞富集生态位）和N03_Perivascular（血管周围生态位）的比例显著增加。这些结果表明，TLS样结构的形成及B细胞免疫应答可能与PDAC的低神经浸润表型相关。

在基质区室中，高神经浸润（high-NI）的PDAC肿瘤组织表现出肌成纤维细胞性CAF（myCAF）和肿瘤相关CAF（tCAF）亚群比例升高。其中：

F01_myCAF-MMP11

• 高表达基质金属蛋白酶（MMP）、胶原蛋白编码基因
• 富集细胞粘附与迁移相关分子

F03_tCAF-MME

• 显著上调转移相关基因（MME、NDRG1），与乳腺癌中报道的tCAF特征一致
• 高表达ENO1、VEGFA，并富集缺氧与血管生成通路，提示其定位于肿瘤缺氧区域

相比之下，具有祖细胞样特征的CAF亚群（表达DPT、CFD、PI16等标志基因）在高NI组织中比例较低。空间转录组（ST）数据进一步证实：

• 高NI组织：myCAFs显著浸润
• 低NI组织：以祖细胞样CAFs为主

通过整合公共ST数据集和内部独立样本的验证队列，成功复现了低NI与高NI组织间的上述差异。这些发现系统揭示了与PDAC神经浸润状态相关的免疫-基质亚群分布及空间生态位特征。

结果4、受侵神经和非受侵神经周围微环境

在明确低NI与高NI肿瘤微环境（TME）的整体差异后，进一步聚焦神经周围生态位，通过分析未浸润神经（non-invaded nerves）与浸润神经（invaded nerves）邻近区域的细胞组成，揭示潜在的神经互作亚群。研究选取以下三类空间位点：

• 神经共定位位点（523个浸润神经位点/230个未浸润神经位点）
• 近神经位点（神经周围两层spot，约200 μm范围）

未浸润神经的免疫保护性微环境

细胞组成：

• 显著富集B03_GCB_RGS13（生发中心B细胞）、T10_CD4_Tfh-like_CXCL13（滤泡辅助T样细胞）、M04_cDC_LAMP3（成熟树突细胞）等TLS核心组分

空间分布规律：

• N01_TLS与N04_Plasma-enriched生态位比例随与神经距离缩短而递增，该趋势在浸润神经周围消失

为阐明未浸润神经（non-invaded nerves）与浸润神经（invaded nerves）周围微环境的调控机制，通过COMMOT（基于最优传输的细胞通讯分析）整合配体-受体表达与ECM-受体互作数据，系统评估了以下信号通路活性：

1. 未浸润神经的适应性免疫保护微环境

关键通路：

• 白细胞招募：CXCL、CCL、IL-16信号显著激活
• 淋巴细胞增殖与分化：BAFF、APRIL、IL-2、LIGHT、CD40通路活跃

神经-TLS互作机制：

• 对比浸润神经，未浸润神经位点中CXCL12-CXCR4配体-受体对显著上调）
• mIHC证实神经内及周围成纤维细胞高表达CXCL12，可能招募CXCR4+ B细胞促进TLS形成，与既往研究一致

2. 浸润神经的促炎与免疫抑制微环境

免疫抑制通路：

• IL-10、TGF-β信号激活，与T细胞耗竭标志物表达升高相符

促炎反应特征：

• IL-1信号通路上调，富集于浸润神经周围的M07_Macro-NLRP3，模拟伤口炎症反应

机制模型总结

结果5、解析未浸润神经与浸润神经的细胞组成特征

通过整合单细胞/细胞核RNA测序（sc/snRNA-seq）与空间转录组（ST）数据，系统解析肿瘤相关神经的细胞组成特征。

神经内特殊成纤维细胞亚群的发现

F07_Fibro-NRP2的特征：

• 在UMAP图中独立聚类
• 高表达经典成纤维细胞标志物（LUM、DCN）及轴突生成相关基因（NGFR、NRP2、AUTS2、RGMA）
• ST数据定位显示其特异性定位于神经内部
• MISTy空间分析证实其与Schwann细胞显著共定位，提示为神经内膜成纤维细胞

功能特性：

• 特异性表达载脂蛋白D（APOD），与蛙类和小鼠神经研究一致
• 通路分析显示参与干细胞分化、血管生成及髓系细胞稳态调控

神经内髓系细胞的动态重塑

Schwann细胞的异质性解析

S01_Schwann-ABCA8：

• 髓鞘化表型（高表达MPZ、MBP、EGR2）
• ABCA8参与髓鞘合成

S02_Schwann-TGFBI：

• 低髓鞘基因，高ECM基因（FN1、COL12A1、TGFBI）
• 分泌促瘤生长因子（FGF5、MDK、BTC）

S03_Schwann-SERPINA3：

• 修复性表型（高表达AP-1家族基因：JUNB/JUND/FOS）
• 富集损伤响应通路（热休克/内肽酶调控/成纤维细胞增殖）
• ST分析显示在浸润神经中比例显著升高（与Bungner带修复Schwann细胞一致）

分析结果

• 神经内存在独特的NRP2+成纤维细胞亚群，可能通过APOD参与神经-肿瘤互作
• 神经浸润伴随巨噬细胞表型转换（LYVE1+→SPP1+），提示损伤-修复机制激活
• TGFBI+Schwann细胞可能通过ECM重塑促进神经周围转移微环境形成。

结果6、一个独特的转化Schwann细胞亚群促进神经侵袭（TGFBI+Schwann细胞在神经浸润中的促癌机制）

尽管Schwann细胞在体外能诱导癌细胞迁移，但其特定亚群在神经浸润（NI）中的作用尚不明确。通过分析肿瘤远端至邻近区域的Schwann细胞分布，发现：

1. 空间分布与细胞互作特征

• S02_Schwann-TGFBI在肿瘤邻近区比例显著升高，而髓鞘化亚群S01_Schwann-ABCA8减少
• mIHC显示TGFBI+SOX10+Schwann细胞与浸润癌细胞直接接触，沿神经浸润前沿排列

2. 功能调控网络

ECM重塑与生长因子分泌：

• 高表达FN1、COL12A1等ECM基因及FGF5、MDK等生长因子，可能促进癌细胞迁移与存活
• 通路分析显示其富集钙黏蛋白结合、整合素信号及神经元突触发育调控

体外实验验证：

• 共培养实验证实sNF96.2Schwann细胞（转录组匹配S02_Schwann-TGFBI）增强PANC-1迁移能力

3. TGF-β1驱动的表型诱导

转录调控：SCENIC分析揭示RUNX1、TFAP2A、SMAD1等转录因子激活，与TGF-β信号通路相关

微环境信号溯源：

• CytoSig/NicheNet预测TGF-β1和HGF为关键诱导因子
• 高NI组中M07_Macro-NLRP3（促炎巨噬细胞）和F01_myCAF-MMP11（肌成纤维CAF）是TGF-β1主要来源

功能阻断实验：

• TGF-β1处理上调sNF96.2细胞中TGFBI/FN1表达，抑制ABCA8，该效应可被TGF-βRI抑制剂SB505124逆转
• TGF-β1激活的Schwann细胞通过分泌因子增强PANC-1迁移/侵袭能力

4. 临床意义

• TCGA数据分析显示S02_Schwann-TGFBI特征与PDAC患者不良预后显著相关
• 外部数据集验证NI阳性样本中Schwann细胞更接近S02_Schwann-TGFBI表型

机制模型总结

"TGF-β1-TGFBI+Schwann细胞-癌细胞"轴：

• 1、启动阶段：浸润神经周围的巨噬细胞（M07_Macro-NLRP3）和CAFs（F01_myCAF）分泌TGF-β1
• 2、表型转换：TGF-β1诱导Schwann细胞向TGFBI+亚型分化，伴随ECM重塑和生长因子分泌
• 3、促侵袭效应：TGFBI+Schwann细胞通过物理接触和分泌因子引导癌细胞迁移

简单总结一下

1. 神经内膜成纤维细胞新亚群的发现

F07_Fibro-NRP2特征：

• 特异性表达轴突生成相关基因（NGFR/NRP2等）
• 空间定位神经内部（首次揭示其全转录组特征）
• 高表达载脂蛋白D（APOD），提示可能通过脂质转移保护神经元免受氧化损伤

2. Schwann细胞异质性调控网络

机制验证：

• 体外实验证实TGF-β1诱导sNF96.2细胞（S02类似）促癌迁移，可被TGF-βRI抑制剂阻断
• TCGA数据验证S02特征与患者生存率显著负相关

3. 神经浸润前沿的细胞互作

关键效应细胞：

• NLRP3+促炎巨噬细胞（M07_Macro）与肌成纤维CAF（F01_myCAF）
• 高表达TGF-β1，驱动Schwann细胞向S02表型转化

空间特征：

• 浸润区：富集促侵袭的myCAF/TAM，伴随TGF-β信号激活
• 未浸润区：LYVE1+定居巨噬细胞与祖细胞样CAF为主

4. 神经-三级淋巴结构（NTS）的生物学意义

• 形成机制：神经相关成纤维细胞通过CXCL12-CXCR4轴招募B细胞促进TLS组装
• 科学争议：神经元对TLS内免疫活性的双向调控（激活/抑制）仍需人源化模型验证

最后来看看方法

单细胞数据分析

CNV分析

空间转录组部分

生活很好，有你更好