Day 7_测序知识- CG

1. 测序原理和过程

参考文章链接1

参考文章链接1

参考文章链接1

测序：检测DNA或RNA上AT(U)GC顺序和数量。

1.1 第一代测序：

Sanger-双脱氧链终止法原理：设置4个反应体系，分别加入DNA、引物、酶、4种dNTP，和其中1种带有标记ddNTP。在加入ddATP反应体系中，当ddATP和T碱基结合，反应终止，在这个反应体系中，ddATP会结合DNA上所有T位点，其余3种反应体系同上。

1.2 第二代测序

目前二代测序应用最广泛的是illumina公司的边合成边测序。

二代测序：分为样品收集 > 文库建库 > 测序三个步骤。将待测DNA打断成200-800bp片段，经过末端补齐并加A、与特有的测序接头连接，经过扩增建立测序文库。

接头：

双端index接头

加接头方式：

• 先在fragment DNA的两端加上PE adapter, 然后再引入和P5/P7 oligo互补配对的序列以及index序列（上图所示）
• 直接在fragment DNA的两端直接加上full Y-adapter, adapter中已经包括了和P5/P7 oligo互补的序列, index, 以及Read1/Read2的测序引物。

接头包含：P5/P7 是和测序仪上配对的序列；index1/2是barcode，用于区分不同样本；PE adaptor是建库PCR富集时候需要用的引物序列，另一部分是测序时需要用的引物。

测序仪1个flow有8条lane，lane上随机分布两种接头，__p5‘（与P5互补），P7（与P7'互补）。 __

测序过程：

• 序列只能一开始是利用p5接头互补，然后第一轮扩增（p5 > p7是模版链，需要的测序），形成互补链。
• 洗脱：互补链（'p7>'p5）由于'p5在lane上不会被洗脱,而模版链被洗脱。

-桥式形成：互补链'p7和lane上p7互补结合形成桥，可以快速扩增p7链（Forward strand，模版链）。

• 35轮桥式扩增形成cluster（一群完全相同的序列，放大信号作用）。
• 解链：甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）选择性切掉'p5连接的链（互补链）
• 双端测序之Forward Strand：illumina采取了“一次加一个荧光碱基，用完失效。先是primer结合到靠近p5的sequencing primer binding site1上，再加入特殊的dNTP【它的3‘ 羟基被叠氮基团替代，因此每次只能添加一个dNTP；还含有荧光基团，能激发不同颜色】；在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉； 再加入激发荧光缓冲液，用激光激发荧光信号，光学设备记录荧光信号的记录，计算机将光学信号转化为测序碱基。再加入化学试剂淬灭荧光信号并使dNTP 3’ 叠氮基团变成羟基，这样能继续向下进行再加一个，并且保证这个不再发出荧光。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出。得到了Forward Strand序列。
• Index测序： 上面的循环结束后，read product被冲掉，index1 primer和链上的index1 互补配对，进行index1的检测。测完后，洗脱产物，得到index1 的序列。接下来p5与lane上的p5‘配对，测得了index2，并洗脱。
• 双端测序之Reverse Strand： 洗脱掉index2 产物后，还是一个桥式扩增，得到双链，再变性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand， 除去测完的Forward strand。然后和测Forward一样，也是先连接primer，只是连接的位点是Primer Binding Site2，测完后得到reverse strand序列。

1.3 三代测序

在第二代测序的基础上，人们还希望提高测序效率、提高测序通量、提高测序准确率、避免PCR扩增和避免荧光检测等。

根据不同的发展方向，目前发展出多种不同的三代测序方法。

1.3.1 实时单分子测序（real-time single-molecule）

边合成边测序，四种分别荧光标记的dNTPs参与到DNA聚合酶主导的链合成反应中，每类碱基在被添加上去的时候，会显示不同的荧光。当把这个链合成反应控制在一个DNA母板链、一个DNA聚合酶，一个相对封闭的反应空间的时候，就可以方便地对每次加入的荧光进行判别。

1.3.2 complete genomics公司的复合探针-锚定连接技术（combinatorial probe-anchor ligation，cPAL）：依靠荧光检测来测序，提高了测序速度和通量

1.3.3 Life technologies公司的离子流探测测序设备（Ion torrent）

使用离子流场效应半导体感应器（ion-sensitive field effect transistor）,依靠边合成边测序的中心概念，检测每次添加碱基时候释放出的离子流，从而避免了传统第二代的荧光检测。

1.3.4 Oxford nanopore公司的纳米孔单分子测序技术，避免了荧光检测和对主体DNA序列的PCR扩增。

1.4 第一代、二代、三代测序比较

• 一代测序最大的优势在准确性上，但是成本高、通量低。
• 二代测序大幅度提高了测序速度，降低了测序成本，保持了高准确性。缺点是读长短，拼接困难，pcr技术增加了测序的错误率。在进行基因组组装或者结构变异分析的时候没有优势。
• 三代测序，解决了二代测序中PCR复制引入的误差以及复制偏倚，并且因为三代读长长的优势，测序后不用拼接，直接读出整个基因的全长。这解决的二代没法解决的生物学问题：鉴定新的转录本。但其成本高，测序准确性差。

2. 常用数据格式

参考文章链接

数据格式详解链接

2.1 DNA序列表征

A、C、G、T、U、R(GA)、Y(TC)、K(GT酮)、M(AC氨基)、S(GC)、W(AT)、B(GTC)、D(GAT)、H（ACT）、V（GCA）、N（AGCT）

2.2 fastq和fasta

fastq格式：基于文本，保存生物序列和测序质量信息的格式。一般包含4行。

• 第一行：由‘@’开始，后面跟着序列ID和可选的描述，序列ID是唯一的。
• 第二行：碱基序列；
• 第三行：由‘+’开始，后面是序列的描述信息；
• 第二行序列的质量评价(quality value)

fasta格式：

• 以“>”为开头，fasta格式标志。
• 序列ID号，gi号，NCBI数据库的标识符，具有唯一性。
• 序列描述。
• 碱基序列，序列中允许空格、换行、空行，一般一行60个。

2.3 GenBank格式

以LOCUS和一些注释行开始。

序列的开头以“ORIGIN”标记，末尾以“//”标记。

2.4 EMBL格式

以标识符行（ID）开头，后面跟着更多注释行。

序列的开头以“SQ”开头标记，序末尾以“//”标记。