单细胞转录组｜单细胞数据分析中细胞类型的智能识别与注释

library(Seurat)
library(SingleR)
library(celldex)


# 提取Seurat对象的归一化表达矩阵
expression_matrix <- GetAssayData(seurat_object, slot="data")
# 使用celldex包提供的小鼠参考数据集，我使用的数据集下载自10x官网小鼠脑。
reference_data <- celldex::MouseRNAseqData()
#celldex包也提供人的参考数据集

# 运行 SingleR 注释
labels <- colData(reference_data)$label.main
singleR_results <- SingleR(test = expression_matrix, ref = reference_data, labels = labels)

#singleR_results <- SingleR(test = expression_matrix, ref = reference_data)
# 查看SingleR的注释结果
head(singleR_results)

# 将注释结果添加到Seurat对象中
seurat_object$SingleR_labels <- singleR_results$labels
# 可视化结果（例如使用UMAP）
pdf("result/Dimplot_celltype_singelR.pdf", width = 50, height = 10)
DimPlot(seurat_object, group.by = "SingleR_labels", label = TRUE)
dev.off()

library(dplyr)
library(Seurat)
library(patchwork)
library(ggplot2)

# 读取 Seurat 对象，这里是去除双胞，整合处理之后的rds文件
seurat_object <- readRDS("integration_Normal_Harmony.rds")

# 进行差异表达分析，找出每个聚类的标记基因
markers <- FindAllMarkers(seurat_object, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)

# 查看前几行标记基因
head(markers)
#填写API
Sys.setenv(OPENAI_API_KEY = 'bb56b20d26cb6292d86e676')
Sys.setenv(OPENAI_API_BASE_URL = "https://gpt-apeeoai.cv1")
#加载包#Load packages
library(GPTCelltype)
library(openai)

# Run gptcelltype function
res <- gptcelltype(markers, tissuename = 'mouse__cluster_celltype', model = 'gpt-4')

# 添加到原来的对象中
seurat_object@meta.data$celltype <- as.factor(res[as.character(Idents(seurat_object))])

# Visualize the result using DimPlot
pdf("result/Dimplot_celltype.pdf", width = 50, height = 10)
DimPlot(seurat_object, pt.size = 1,group.by = 'celltype')
dev.off()

# 准备待注释数据,确保数据只有一个 layers。
seob <- JoinLayers(seob, assay = "RNA")

# 准备参考数据集
## 1. 查看可用数据集
library(SeuratData)
AvailableData() -> temp

## 2. 安装数据集
## InstallData("pbmc3k")
## install.packages("pbmc3k.SeuratData_3.1.4.tar.gz", repos = NULL, type = "source")

## 3. 加载数据集
pbmc3k <- LoadData("pbmc3k")

## 4. 更新到 V5 格式
pbmc3k <- UpdateSeuratObject(pbmc3k)

# 处理参考数据集
library(tidyverse)
pbmc3k <- SCTransform(object = pbmc3k) %>%
             RunPCA(verbose = FALSE) %>%
             RunUMAP(dims = 1:30, verbose = FALSE)

# 自动注释
## 找到锚点：是在两个数据集中找到相似的细胞，计算它们的相似性锚点。
anchors <- FindTransferAnchors(
  reference = pbmc3k,  # 参考数据集
  query = seob,          # 目标数据集
  normalization.method = "SCT",  # SCTransform 标准化
  reference.reduction = "pca",
  dims = 1:30             # 使用 PCA 的前 30 个主成分
)

## 传递注释：将参考数据集中的细胞类型注释转移到目标数据集中
transfer <- TransferData(
  anchorset = anchors,
  refdata = pbmc3k$seurat_annotations, # 参考数据集中的细胞类型注释
  dims = 1:30)

## 添加注释
seob <- AddMetaData(
  seob, 
  metadata = transfer, 
  col.name = "predicted.id")

# 可视化
DimPlot(seob, 
        reduction = "umap", 
        group.by  = c("seurat_clusters", "predicted.id"),
        label = T)

library(Seurat)

# 读取 Seurat 对象
#我用的已经处理好的数据
seurat_object <- readRDS("result/integration_Normal_Harmony.rds")

# 进行差异表达分析，找出每个聚类的标记基因
markers <- FindAllMarkers(seurat_object, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)

# 查看前几行标记基因
head(markers)

#每个簇中选择前10差异表达基因表达量最高的
top2 <- markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n=2,wt=avg_log2FC)
g=unique(top2$gene)
DoHeatmap(seurat_object, features = g) + NoLegend()+
  scale_fill_gradientn(colors = c("#2fa1dd", "white", "#f87669"))

DotPlot(seurat_object,features=g,cols="RdYlBu")+
  RotatedAxis()

# 假设已经找到了相关的细胞类型标记
seurat_object$cell_type <- ifelse(seurat_object$seurat_clusters == 0, "T cells",
                                  ifelse(seurat_object$seurat_clusters == 1, "B cells", "Other"))

# 可以为每个群体命名
table(seurat_object$cell_type)

# 可视化手动注释结果
DimPlot(seurat_object, group.by = "cell_type")